Из венозной крови можно извлечь 55-58 об.% углекислого газа. Большая часть СО2, извлекаемого из крови, происходит из имеющихся в плазме и эритроцитах солей угольной кислоты и только около 2,5 об.% углекислого газа растворено и около 4-5об.% находится в соединении с гемоглобином в виде карбогемоглобина.
Образованно угольной кислоты из углекислого газа происходит в эритроцитах, где содержится фермент карбоангидраза, являющийся мощным катализатором, ускоряющим реакцию гидратации СО2.
Связывание углекислого газа кровью в капиллярах большого круга. Углекислый газ, образующийся в тканях, диффундирует в кровь кровеносных капилляров, так как напряжение СО2 в тканях значительно превышает его напряжение в артериальной крови. Растворяющийся в плазме СО2 диффундирует внутрь эритроцита, где под влиянием карбоангидразы он мгновенно превращается в угольную кислоту,
Согласно расчетам, активность карбоангидразы в эритроцитах такова, что реакция гидратации углекислоты ускоряется в 1500-2000 раз. Так как весь углекислый газ внутри эритроцита превращается в угольную кислоту, то напряжение СО2 внутри эритроцита близко к нулю, поэтому все новые и новые количества СО2 поступают внутрь эритроцита. В связи с образованием угольной кислоты из СО3 в эритроците концентрация ионов НСО3" возрастает, и они начинают диффундировать в плазму. Это возможно потому, что поверхностная мембрана эритроцита проницаема для анионов. Для катионов мембрана эритроцита практически непроницаема. Взамен ионов НСО3" в эритроциты входит ион хлора. Переход ионов хлора из плазмы внутрь эритроцита освобождает в плазме ионы натрия, которые связывают поступающие нз эритроцита ионы НСО3, образуя NaHCО3 Химический анализ плазмы венозной крови показывает значительное увеличение в ней бикарбоната.
Накопление внутри эритроцита анионов приводит к повышению осмотического давления внутри эритроцита, а это вызывает переход воды из плазмы через поверхностную мембрану эритроцита. В результате объем эритроцитов в капиллярах большого круга увеличивается. При исследовании с помощью гематокрнта установлено, что эритроциты занимают 40% объема артериальной крови и 40,4% объема венозной крови. Из этого следует, что объем эритроцитов венозной крови больше, чем эритроцитом артериальной, что объясняется проникновением в них воды.
Одновременно с поступлением СО2 внутрь эритроцита и образованием в нем угольной кислоты происходит отдача кислорода оксигемоглобином и превращение его в редуцированный гемоглобин. Последний является значительно менее диссоциирующей кислотой, чем оксигемоглобин и угольная кислота. Поэтому при превращении оксигемоглобина в гемоглобин Н2СО3 вытесняет из гемоглобина ионы калия и, соединяясь с ними, образует калиевую соль бикарбоната.
Освобождающийся Н˙ ион угольной кислоты связывается гемоглобином. Так как редуцированный гемоглобин является малодиссоциированной кислотой, то при этом не происходит закисления крови и разница рН венозной и артериальной крови крайне невелика. Происходящую в эритроцитах тканевых капилляров реакцию можно представить следующим образом:
КНbO2 + Н2СO3= HHb + O2 + КНСO3
Из изложенного следует, что оксигемоглобин, превращаясь в гемоглобин и отдавая связанные им основания углекислоте, способствует образованию бикарбоната и транспорту в таком виде углекислоты. Кроме того, гкмоглобин образует химическое соединение с СО2 - карбогемоглобин. Наличие в крови соединения гемоглобина с углекислым газом было установлено путем следующего опыта. Если к цельной крови прибавить цианистый калий, который полностью инактивирует карбоангидразу, то оказывается, что эритроциты такой крови связывают больше СО2, чем плазма. Отсюда был сделан вывод, что связывание СО2 эритроцитами после инактивирования карбоангидразы объясняется наличием в эритроцитах соединения гемоглобина с СО2. В дальнейшем выяснилось, что СО2 присоединяется к аминной группе гемоглобина, образуя так называемую карбаминовую связь.
Реакция образования карбогемоглобина может идти в одну или другую сторону в зависимости от напряжения углекислого газа в крови. Хотя небольшая часть всего количества углекислого газа, которое может быть извлечено из крови, находится в соединении с гемоглобином (8-10%), однако роль этого соединения в транспорте углекислоты кровью достаточно велика. Примерно 25-30% углекислого газа, поглощаемого кровью в капиллярах большого круга, вступает в соединение с гемоглобином, образуя карбогемоглобин.
Отдача СО2 кровью в легочных капиллярах. Вследствие более низкого парциального давления СО2 в альвеолярном воздухе по сравнению с напряжением его в венозной крови углекислый газ переходит путем диффузии из крови легочных капилляров в альвеолярный воздух. Напряжение СО2в крови падает.
Одновременно с этим вследствие более высокого парциального давления кислорода в альвеолярном воздухе по сравнению с его напряжением в венозной крови кислород поступает из альвеолярного воздуха в кровь капилляров легких. Напряжение О2 в крови возрастает, и гемоглобин превращается в оксигемоглобин. Так как последний является кислотой, диссоциация которой значительно выше, чем гемоглобина угольной кислоты, то он вытесняет угольную кислоту из ее калиевой. Реакция идет следующим образом:
ННb + O2 + КНСO3= КНbO2+H2CO3
Освободившаяся из своей связи с основаниями угольная кислота расщепляется карбоангидразой на углекислый газ в воду. Значение карбоангидразы в отдаче углекислого газа в легких видно из следующих данных. Для того чтобы произошла реакция дегидратации Н2СО3 растворенной в воде, с образованием того количества углекислого газа, которое выходит из крови за время ее нахождения в капиллярах легких, требуется 300 секунд. Кровь же проходит через капилляры легких в течение 1-2 секунд, но за это время успевает произойти дегидратация угольной кислоты внутри эритроцита и диффузия образовавшегося СО2 сначала в плазму крови, а затем в альвеолярный воздух.
Так как в легочных капиллярах уменьшается в эритроцитах концентрация ионов НСО3, то эти ионы из плазмы начинают диффундировать в эритроциты, а ионы хлора диффундируют из эритроцитов в плазму. В связис тем что напряжение углекислого газа в крови легочных капилляров уменьшается, карбаминовая связь расщепляется и карбогемоглобин отдает углекислый газ.
Кривые диссоциации соединений угольной кислоты в крови. Как мы уже говорили, свыше 85% углекислого газа, которое может быть извлечено из крови подкислении ее, освобождается в результате расщепления бикарбонатов (калия в эритроцитах и натрия в плазме).
Связывание углекислого газа и отдача его кровью зависят от его парциального напряжения. Можно построить кривые диссоциации соединений углекислоты в крови, подобные кривым диссоциации оксигемоглобина. Для этого по оси ординат откладывают объемные проценты связанного кровью углекислого газа, а по оси абсцисс- парциальные напряжения углекислого газа. Нижняя кривая нарис. 58 показывает связывание углекислого газа артериальной кровью, гемоглобин которой почти полностью насыщен кислородом. Верхняя кривая показывает связывание кислого газа венозной кровью.
Различие в высоте этих кривых зависит от того, что артериальная кровь, богатая оксигемоглобином, обладает меньшей способностью связывать углекислый газ по сравнению с венозной кровью. Являясь более сильной кислотой, чем угольная кислота, оксигемоглобин отнимает основания у бикарбонатов и этим способствует освобождению угольной кислоты. В тканях оксигемоглобин, переходя в гемоглобин, отдает связанные с ним основания, увеличивая связывание кислого газа кровью.
Точка А на нижней кривой на рис. 58 соответствует напряжению кислоты, равному 40 мм рт. ст., т. е. тому напряжению, которое фактически имеется в артериальной крови. При таком напряжении связано 52 об.% СО2. Точка V на верхней кривой соответствует напряжению кислого газа 46 мм рт. ст., т. е. фактически имеющемуся в венозной крови. Как видно из кривой, при таком напряжении венозная кровь связывает 58 об.% углекислого газа. Линия AV, соединяющая верхнюю и нижнюю кривую, соответствует тем изменениям способности связывать углекислый газ, которые происходят при превращении артериальной крови в венозную или, наоборот, венозной крови в артериальную.
Венозная кровь благодаря тому, что содержащийся в ней гемоглобин переходит в оксигемоглобин, в капиллярах легких отдает около 6 об.% СО2. Если бы в легких гемоглобин не превращался в оксигемоглобин, то, как видно из кривой, венозная кровь при имеющемся в альвеолах парциальном давлении углекислого газа, равном 40 мм рт. ст.. связывала бы 54 об.% СО2, следовательно, отдала бы не 6, а только 4об.%. Равным образом, если бы артериальная кровь в капиллярах большого круга не отдавала своего кислорода, т. е. если бы гемоглобин ее оставался насыщенным кислородом, то эта артериальная кровь при парциальпом давлении углекислого газа, имеющемся в капиллярах тканей тела, смогла бы связат не 58 об.% СО2, а лишь 55 об.%.
Карбоангидраза (синоним: карбонатдегидратаза, карбонатгидролиаза) - фермент, катализирующий обратимую реакцию гидратации диоксида углерода: СО 2 + Н 2 О Û Н 2 СО 3 Û Н + + НСО 3 . Содержится в эритроцитах, клетках слизистой оболочки желудка, коре надпочечников, почках, в незначительных количествах - в ц.н.с., поджелудочной железе и других органах. Роль карбоангидразы в организме связана с поддержанием кислотно-щелочного равновесия , транспортом СО 2 , образованием соляной кислоты слизистой оболочкой желудка. Активность карбоангидразы в крови в норме довольно постоянна, но при некоторых патологических состояниях она резко меняется. Повышение активности карбоангидразы в крови отмечается при анемиях различного генеза, нарушениях кровообращения II-III степени, некоторых заболеваниях легких (бронхоэктазах, пневмосклерозе), а также при беременности. Снижение активности этого фермента в крови происходит при ацидозе почечного генеза, гипертиреозе. При внутрисосудистом гемолизе активность карбоангидразы появляется в моче, в то время как в норме она отсутствует. Контролировать активность карбоангидразы в крови целесообразно во время оперативных вмешательств на сердце и легких, т.к. она может служить показателем адаптивных возможностей организма, а также при терапии ингибиторами карбоангидразы - гипотиазидом, диакарбом.
Для определения активности карбоангидразы применяют радиологические, иммуноэлектрофоретические, колориметрические и титриметрические методы. Определение производят в цельной крови, взятой с гепарином, или в гемолизированных эритроцитах. Для клинических целей наиболее приемлемы колориметрические методы определения активности карбоангидразы (например, модификации метода Бринкмана), основанные на установлении времени, необходимого для сдвига рН инкубационной смеси с 9,0 до 6,3 в результате гидратации СО 2 . Воду, насыщенную углекислотой, смешивают с индикаторно-буферным раствором и определенным количеством сыворотки крови (0,02 мл ) или взвеси гемолизированных эритроцитов. В качестве индикатора используют феноловый красный. По мере диссоциации молекул угольной кислоты все новые молекулы СО 2 подвергаются ферментативной гидратации. Для получения сравнимых результатов реакция должна протекать всегда при одинаковой температуре, наиболее удобно поддерживать температуру тающего льда - 0°. Время контрольной реакции (спонтанной реакции гидратации СО 2) в норме составляет 110-125 с . В норме при определении этим методом активность карбоангидразы в среднем равна 2-2,5 условным единицам, а в пересчете на 1 млн. эритроцитов 0,458 ± 0,006 условным единицам (за единицу активности карбоангидразы принимают увеличение скорости катализируемой реакции в 2 раза).
Библиогр.: Клиническая оценка лабораторных тестов, под ред. Н.У. Тица, пер. с англ., с. 196, М., 1986.
Карбоангидраза (синоним: карбонатдегидратаза, карбонатгидролиаза) - фермент, катализирующий обратимую реакцию гидратации диоксида углерода: СО 2 + Н 2 О Û Н 2 СО 3 Û Н + + НСО 3 . Содержится в эритроцитах, клетках слизистой оболочки желудка, коре надпочечников, почках, в незначительных количествах - в ц.н.с., поджелудочной железе и других органах. Роль К. в организме связана с поддержанием кислотно-щелочного равновесия , транспортом СО 2 , образованием соляной кислоты слизистой оболочкой желудка. Активность К. в крови в норме довольно постоянна, но при некоторых патологических состояниях она резко меняется. Повышение активности К. в крови отмечается при х различного генеза, нарушениях кровообращения II-III степени, некоторых заболеваниях легких (бронхоэктазах, пневмосклерозе), а также при беременности. Снижение активности этого фермента в крови происходит при ацидозе почечного генеза, гипертиреозе. При внутрисосудистом гемолизе активность К. появляется в моче, в то время как в норме она отсутствует.
Контролировать активность К. в крови целесообразно во время оперативных вмешательств на сердце и легких, т.к. она может служить показателем адаптивных возможностей организма, а также при терапии ингибиторами карбоангидразы - гипотиазидом, диакарбом.Для определения активности К. применяют радиологические, иммуноэлектрофоретические, колориметрические и титриметрические методы. Определение производят в цельной крови, взятой с гепарином, или в гемолизированных эритроцитах. Для клинических целей наиболее приемлемы колориметрические методы определения активности К. (например,
модификации метода Бринкмана), основанные на установлении времени, необходимого для сдвига рН инкубационной смеси с 9,0 до 6,3 в результате гидратации СО 2 . Воду, насыщенную углекислотой, смешивают с индикаторно-буферным раствором и определенным количеством сыворотки крови (0,02 мл ) или взвеси гемолизированных эритроцитов. В качестве индикатора используют феноловый красный. По мере диссоциации молекул угольной кислоты все новые молекулы СО 2 подвергаются ферментативной гидратации. Для получения сравнимых результатов реакция должна протекать всегда при одинаковой температуре, наиболее удобно поддерживать температуру тающего льда - 0°. Время контрольной реакции (спонтанной реакции гидратации СО 2) в норме составляет 110-125 с . В норме при определении этим методом активность К. в среднем равна 2-2,5 условным единицам, а в пересчете на 1 млн. эритроцитов 0,458 ± 0,006 условным единицам (за единицу активности К. принимают увеличение скорости катализируемой реакции в 2 раза).Библиогр.: Клиническая оценка лабораторных тестов, под ред. Н.У. Тица, пер. с англ., с. 196, М., 1986.
I
Карбоангидра́за (синоним: карбонатдегидратаза, карбонатгидролиаза)
фермент, катализирующий обратимую реакцию гидратации диоксида углерода: СО 2 + Н 2 О ⇔ Н 2 СО 3 ⇔ Н + + НСО 3 . Содержится в эритроцитах, клетках слизистой оболочки желудка, коре надпочечников, почках, в незначительных количествах - в ц.н.с., поджелудочной железе и других органах. Роль К. в организме связана с поддержанием кислотно-щелочного равновесия (Кислотно-щелочное равновесие),
транспортом СО 2 , образованием соляной кислоты слизистой оболочкой желудка. Активность К. в крови в норме довольно постоянна, но при некоторых патологических состояниях она резко меняется. Повышение активности К. в крови отмечается при анемиях различного генеза, нарушениях кровообращения II-III степени, некоторых заболеваниях легких (бронхоэктазах, пневмосклерозе), а также при беременности. Снижение активности этого фермента в крови происходит при ацидозе почечного генеза, гипертиреозе. При внутрисосудистом гемолизе активность К. появляется в моче, в то время как в норме она отсутствует. Контролировать активность К. в крови целесообразно во время оперативных вмешательств на сердце и легких, т.к. она может служить показателем адаптивных возможностей организма, а также при терапии ингибиторами карбоангидразы - гипотиазидом, диакарбом. Для определения активности К. применяют радиологические, иммуноэлектрофоретические, колориметрические и титриметрические методы. Определение производят в цельной крови, взятой с гепарином, или в гемолизированных эритроцитах. Для клинических целей наиболее приемлемы колориметрические методы определения активности К. (например, модификации метода Бринкмана), основанные на установлении времени, необходимого для сдвига рН инкубационной смеси с 9,0 до 6,3 в результате гидратации СО 2 . Воду, насыщенную углекислотой, смешивают с индикаторно-буферным раствором и определенным количеством сыворотки крови (0,02 мл
) или взвеси гемолизированных эритроцитов. В качестве индикатора используют феноловый красный. По мере диссоциации молекул угольной кислоты все новые молекулы СО 2 подвергаются ферментативной гидратации. Для получения сравнимых результатов реакция должна протекать всегда при одинаковой температуре, наиболее удобно поддерживать температуру тающего льда - 0°. Время контрольной реакции (спонтанной реакции гидратации СО 2) в норме составляет 110-125 с
. В норме при определении этим методом активность К. в среднем равна 2-2,5 условным единицам, а в пересчете на 1 млн. эритроцитов 0,458 ± 0,006 условным единицам (за единицу активности К. принимают увеличение скорости катализируемой реакции в 2 раза). Библиогр.:
Клиническая оценка лабораторных тестов, под ред. Н.У. Тица, пер. с англ., с. 196, М., 1986.
- - фермент, катализирующий обратимую реакцию образования угольной кислоты из диоксида углерода и воды. Ингибиторы К. применяют в медицине для лечения нек-рых сердечно-сосудистых и др. заболеваний...
Естествознание. Энциклопедический словарь
- - I Карбоангидра́за фермент, катализирующий обратимую реакцию гидратации диоксида углерода: СО2 + Н2О ⇔ Н2СО3 ⇔ Н+ + НСО3...
Медицинская энциклопедия
- - цинксодержащий фермент группы углерод-кислород-лиаз, катализирующий обратимую реакцию расщепления угольной кислоты до двуокиси углерода и воды...
Большой медицинский словарь
- - угольная ангидраза, карбонат-гидролиаза, фермент класса лиаз, катализирующий обратимое образование угольной кислоты из двуокиси углерода и воды: CO2 + H2O ↔ H2CO3. К. - металлопротеид, содержащий Zn...
Цель работы определить факторы, влияющие на активность цинксодержащей карбоангидразы репродуктивной системы самцов крыс в условиях воздействия низкоинтенсивного микроволнового излучения. Карбоангидраза играет важную роль в метаболизме семенной плазмы и созревании сперматозоидов. Активность карбоангидразы в водно-солевых экстрактах эпидидимисов и семенников крыс контрольной группы, по нашим данным, колеблется в пределах 84,0±74,5 ЕД/мл, что в пересчете на вес ткани составляет 336,0 ±298,0 ЕД/мг. Исследована связь концентрации ионов цинка и полиаминов с активностью карбоангидразы. Активность карбоангидразы репродуктивной системы самцов крыс имеет сложную схему регуляции, очевидно, не исчерпывающуюся описанными нами факторами. На основании полученных результатов можно заключить, что роль различных регуляторов активности этого фермента изменяется в зависимости от степени активности карбоангидразы. Вероятно, высокие концентрации спермина лимитируют транскрипцию гена карбоангидразы, учитывая данные о функциях этого полиамина. Спермидин, вероятно, служит лимитирующим фактором на пострибосомальных этапах регуляции активности карбоангидразы, а путресцин и концентрация ионов цинка - взаимосвязанные факторы активации.
репродуктивная система самцов крыс
концентрация ионов цинка
полиамины
карбоангидраза
1. Бойко О.В. Методические аспекты использования солянокислых спермина и спермидина для идентификации уропатогенной микрофлоры / О.В. Бойко, А.А. Терентьев, А.А. Николаев // Проблемы репродукции. – 2010. – № 3. – С. 77-79.
2. Ильина О.С. Изменение содержания цинка в крови человека при сахарном диабете типа I и особенности гипогликемического действия цинкосодержащего комплекса инсулин-хондроитинсульфат: автореф. дис. ... канд. биол. наук. – Уфа, 2012. – 24 с.
3. Луцкий Д.Л. Белковый спектр эякулятов различной фертильности / Д.Л. Луцкий, А.А. Николаев, Л.В. Ложкина // Урология. – 1998. – № 2. – С. 48-52.
4. Николаев А.А. Активность ферментов спермоплазмы в эякулятах различной фертильности / А.А. Николаев, Д.Л. Луцкий, В.А. Бочановский, Л.В. Ложкина // Урология. – 1997. – № 5. – С. 35.
5. Плосконос М.В. Определение полиаминов в различных биологических объектах / М.В. Плосконос, А.А. Николаев, А.А. Николаев // Астраханская гос. мед. акад. – Астрахань, 2007. – 118 с.
6. Полунин А.И. Использование препарата цинка в лечении мужской субфертильности / А.И. Полунин, В.М. Мирошников, А.А. Николаев, В.В. Думченко, Д.Л. Луцкий // Микроэлементы в медицине. – 2001. – Т. 2. – № 4. – С. 44-46.
7. Haggis G.C., Gortos K. Carbonic anhydrase activity of the reproductive tract tissues of male rats and its relationship to semen production // J. Fert. Reprod. – 2014. - V. 103. - P. 125-130.
Известно, что в репродуктивной системе самцов птиц, млекопитающих и человека велика активность цинксодержащей карбоангидразы . Активность этого фермента оказывает влияние на созревание сперматозоидов, их количество и объем спермы . Но нет сведений об изменении активности карбоангидразы под действием других постоянных компонентов репродуктивной системы, таких как ионы цинка и полиамины (путресцин, спермин и спермидин), которые активно влияют на сперматогенез. Дана лишь общая характеристика последствий изменения активности карбоангидразы на морфофункциональное состояние органов репродуктивной системы самцов крыс, число сперматозоидов, их подвижность .
Целью нашей работы стало исследование активности цинксодержащей карбоангидразы и ее связь с уровнем полиаминов и ионов цинка в ткани репродуктивной системы половозрелых самцов крыс.
Материалы и методы . Экспериментальная часть исследования включала в себя 418 самцов белых крыс линии Wistar. Возраст крыс составлял 6-7 месяцев (половозрелые особи). Масса тела крыс была 180-240 г, содержащихся в стандартных условиях вивария. Во избежание влияния сезонных различий в реакциях на экспериментальные воздействия все исследования проводились в осеннее-зимний период года. Забор семенников и эпидидимисов у крыс проводили под эфирным наркозом (экспериментальные исследования проводились в строгом соответствии с Хельсинкской декларацией о гуманном отношении к животным).
Объектами нашего исследования были водно-солевые экстракты эпидидимисов и семенников половозрелых самцов белых крыс. Экстракты готовили на трис-солянокислом буфере рН = 7.6 в соотношении вес/объем 1/5, после четырехкратного замораживания, оттаивания и центрифугирования при 8000 g в течение 50 мин., пробы замораживали и хранили при -24 °С до исследования.
Определение цинка. К 2 мл исследуемого экстракта добавляли 0,1 мл 10% NaOH и 0,2 мл 1%-ного раствора дитизона в четыреххлористом углероде. В отрицательном контроле добавляли 2 мл дистиллированной воды, в положительном контроле - 2 мл 20 мкмоль раствора сульфата цинка (молярная концентрация стандартного раствора сульфата цинка). Пробы фотометрировали при 535 нм . Расчет концентрации катионов цинка в пробе проводили по формуле: CZn=20 мкмоль × ОП535 Пробы/ОП535 Стандарта, где ОП535 Пробы - оптическая плотность пробы, измеренная при 535 нм; ОП535 Стандарта - оптическая плотность стандартного 20 микромолярного раствора сульфата цинка, измеренная при 535 нм.
Определение карбоангидразы . Способ основан на реакции дегидратации бикарбоната с удалением образующейся в результате дегидратации двуокиси углерода при интенсивном барботировании реакционной среды освобожденным от оксида углерода воздухом и одновременной регистрацией скорости изменения рН. Реакцию инициируют быстрым введением раствора субстрата - бикарбоната натрия (10 мМ) в реакционную смесь, содержащую исследуемый образец. При этом происходит увеличение рН на 0,01-0,05 ед. Образцы (10,0-50,0 мг) эпидидимисов и семенников половозрелых самцов белых крыс гомогенизировали, центрифугировали при 4500 g в течение 30 мин. при 4 °С, и супернатант разбавляют дважды дистиллированной воды при 4 °С до объема, который позволил бы измерить время реакции. Активность карбоангидразы определяют по изменению начального значения рН от 8,2 до 8,7 в реакции дегидратации CO2. Электрометрически измеряют скорость накопления гидроксильных ионов с использованием чувствительного программируемого рН-метра (InoLab pH 7310), сопряженного с ПК. По сдвигу рН от 8,2 до 8,7, как функции от времени на линейном участке, учитывают активность фермента. Рассчитывали среднее время (Т) для 4 измерений. Время изменения рН при спонтанной гидратации СО2 в среде без образца принимали за контроль. Активность карбоангидразы выражали в ферментных единицах (ЕД) на мг влажной ткани по уравнению: ЕД = 2 (Т0 - Т)/ (Т0×мг ткани в реакционной смеси), где Т0 = среднее время для 4 измерений чистого раствора 4 мл охлажденной, насыщенной углекислотой, бидистиллированной воды.
Определение полиаминов. Образцы (100-200 мг) эпидидимисов и семенников половозрелых самцов белых крыс гомогенизировали, суспендировали в 1 мл 0.2 нормальной перхлорной кислоты, чтобы извлечь свободные полиамины, и центрифугировали. К 100 мкл надосадочной жидкости добавляли 110 мкл 1.5 M карбонат натрия и 200 мкл дансил хлорида (раствор 7.5 мг/мл в ацетоне; «Сигма», Мюнхен, Германия). Кроме того, добавляли 10 мкл 0.5 мM диаминогексана в качестве внутреннего стандарта. После 1 часа инкубации при 60 °C в темноте были добавлены 50 мкл раствора пролина (100 мг/мл), чтобы связать свободный дансил хлорид. Затем дансилпроизводные полиаминов (далее - DNSC-полиамины) экстрагировали толуолом, сублимировали в вакуумном испарителе и растворяли в метаноле. Хроматография выполнялись на колонке с обращеннофазным носителем LC 18 (Supelco), в системе высокоэффективной жидкостной хроматографии (Dionex), состоящей из градиентного смесителя (модель P 580), автоматического инжектора (ASI 100) и детектора флуоресценции (RF 2000). Полиамины элюировали в линейном градиенте от 70% до 100% (v/v) метанола в воде при скорости потока 1 мл/мин и определяли на длине волны возбуждения 365 нм и длине волны эмиссии 510 нм. Данные проанализировали, используя программное обеспечение Dionex Chromeleon, и квантификация выполнялась с калибровочными кривыми, полученными из смеси чистых веществ (рис. А).
Высокоэффективная хроматография DNSC-полиаминов:
А - хроматограмма стандартной смеси DNSC-полиаминов; Б - хроматограмма DNSC-полиаминов одного из образцов ткани эпидидимиса и семенников самцов крыс. 1 - путресцин; 2 - кадаверин; 3 - гександиамин (внутренний стандарт); 4 - спермидин; 5 - спермин. По оси абсцисс время в минутах, по оси ординат - флюоресценция. Ненумерованные пики - не идентифицированные примеси
Результаты исследования и обсуждение . Как известно , карбоангидраза играет важную роль в метаболизме семенной плазмы и созревании сперматозоидов. Активность карбоангидразы в водно-солевых экстрактах эпидидимисов и семенников крыс контрольной группы, по нашим данным, колеблется в пределах 84,0±74,5 ЕД/мл, что в пересчете на вес ткани составляет 336,0 ±298,0 ЕД/мг. Столь высокая активность фермента может быть объяснена важной физиологической ролью. Для сравнения: уровень активности этого фермента в других тканях этих же животных значительно ниже (табл. 1), кроме цельной крови, в которой известна высокая активность карбоангидразы эритроцитов. Однако обращает на себя внимание очень широкий разброс значений активности карбоангидразы эпидидимисов и семенников, коэффициент вариации которой составляет более 150% (табл. 1).
Таблица 1
Активность карбоангидразы в тканях половозрелых самцов
|
Ткани самцов крыс |
Активность фермента, ЕД |
Число наблюдений |
Коэффициент вариации, % |
|
ткань мозга |
|||
|
Мышечная ткань |
|||
|
Слизистая желудочно- кишечного тракта |
|||
|
эпидидимисы и семенники |
|||
|
Цельная кровь |
Это свидетельствует о влиянии на активность фермента неучтенных факторов. Существует два обстоятельства, которые объясняют эту особенность. Во-первых, известно, что биологически активные амины, и в том числе полиамины спермидин и спермин, способны активировать карбоангидразу . Именно репродуктивная система самцов является наиболее богатым источником спермина и спермидина . Поэтому мы провели параллельное определение концентрации полиаминов в водно-солевых экстрактах эпидидимисов и семенников самцов крыс . Полиамины спермидин, спермин и путресцин были проанализированы ВЭЖХ, как описано в методах. Показано, что в ткани эпидидимиса и семенников самцов крыс выявлены спермин, спермидин и путресцин (рис. Б).
У здоровых половозрелых самцов крыс уровень спермина 5,962±4,0,91 мкг/г ткани, спермидина 3,037±3,32 мкг/г ткани, путресцина 2,678±1,82 мкг/г ткани, и соотношение спермин/спермидин 1,88-2,91. Причем, по нашим данным, значительным колебаниям подвержен как уровень спермидина, так и уровень спермина (в меньшей степени). Корреляционный анализ показал достоверную положительную связь (r=+0,3) уровней спермина и спермидина, и соответственно спермидина и путресцина (r=+0,42). Видимо, это обстоятельство является одним из факторов, влияющих на высокую дисперсность результатов определения активности карбоангидразы.
Другим регулятором активности карбоангидразы может служить уровень цинка в репродуктивной ткани половозрелых самцов крыс. По нашим данным, уровень иона цинка колеблется в широких пределах, от 3,2 до 36,7 мкг/г ткани суммарного препарата семенников и эпидидимисов половозрелых самцов крыс.
Корреляционный анализ уровня цинка с уровнями спермина, спермидина и активностью карбоангидразы показал разные уровни положительной связи концентрации ионов цинка с этими метаболитами. Ничтожный уровень связи выявлен со спермином (+0,14). При использованном числе наблюдений эта корреляция недостоверна (р≥0,1). Выявлена достоверная положительная корреляция уровня ионов цинка с концентрацией путресцина (+0,42) и концентрацией спермидина (+0,39). Ожидаемо высокая положительная корреляция (+0,63) выявлена и между концентрацией ионов цинка и активностью карбоангидразы.
На следующем этапе мы постарались объединить концентрацию цинка и уровень полиаминов, как факторы регуляции активности карбоангидразы. При анализе вариационных рядов совместного определения концентрации ионов цинка, полиаминов и активности карбоангидразы выявлены некоторые закономерности. Показано, что из 69 проведенных исследований по уровню активности карбоангидразы можно выделить три группы:
1-я группа - высокая активность от 435 до 372 ЕД (число наблюдений 37),
2-я группа - низкая активность от 291 до 216 ЕД (число наблюдений 17),
3-я группа - очень низкая активность от 177 до 143 ЕД (число наблюдений 15).
При ранжировании уровней полиаминов и концентрации ионов цинка с этими группами выявилась интересная особенность, которая не проявлялась при анализе вариационных рядов. Максимальные концентрации спермина (в среднем 9,881±0,647 мкг/г ткани) связаны с третьей группой наблюдений с очень низкой активностью карбоангидразы, а минимальные (в среднем 2,615±1,130 мкг/г ткани) со второй группой с низкой активностью фермента.
Наибольшее число наблюдений связано с первой группой с высоким уровнем активности карбоангидразы, в этой группе концентрации спермина близки к средним значениям (в среднем 4,675±0,725 мкг/г ткани).
Сложную связь с активностью карбоангидразы проявляет концентрация ионов цинка. В первой группе активности карбоангидразы (табл. 2) концентрация ионов цинка также выше значений в других группах (в среднем 14,11±7,25 мкг/г ткани). Далее концентрация ионов цинка падает в соответствии с падением активности карбоангидразы, но это падение не пропорционально. Если во второй группе активность карбоангидразы снижается по сравнению с первой на 49,6% а в третьей на 60,35%, то снижение концентрации ионов цинка происходит во второй группе на 23%, а в третьей на 39%.
Таблица 2
Соотношение концентрации полиаминов и ионов цинка с активностью карбоангидразы
|
Группы активности карбоангидразы, ЕД |
Средняя концентрация спермина, мкг/г ткани |
Средняя концентрация спермидина, мкг/г ткани |
Средняя концентрация путресцина, мкг/г ткани |
Средняя концентрация ионов цинка, мкг/г ткани |
Это свидетельствует о дополнительных факторах влияния на активность этого фермента. Несколько иначе выглядит динамика концентрации путресцина (табл. 2). Уровень этого полиамина падает опережающими темпами, и в третьей группе сравнения уровень путресцина ниже в среднем почти на 74%. Динамика уровня спермидина отличается тем, что «выскакивающие» значения концентрации этого полиамина связаны в первую очередь со второй группой уровня активности карбоангидразы. При высокой активности этого фермента (группа 1) концентрация спермидина немного выше средней по всем наблюдениям, а в третьей группе почти в 4 раза ниже концентрации во второй группе.
Таким образом, активность карбоангидразы репродуктивной системы самцов крыс имеет сложную схему регуляции, очевидно, не исчерпывающуюся описанными нами факторами. На основании полученных результатов можно заключить, что роль различных регуляторов активности этого фермента изменяется в зависимости от степени активности карбоангидразы. Вероятно, высокие концентрации спермина лимитируют транскрипцию гена карбоангидразы, учитывая данные о функциях этого полиамина . Спермидин, вероятно, служит лимитирующим фактором на пострибосомальных этапах регуляции активности карбоангидразы, а путресцин и концентрация ионов цинка взаимосвязанные факторы активации.
В этих условиях оценка влияния внешних факторов (в том числе изменяющих репродуктивную функцию) на активность карбоангидразы, как одного из важных звеньев метаболизма репродуктивной системы самцов млекопитающих, становится не только важным, но и довольно сложным процессом, требующим большого количества контролей и многосторонней оценки.
Библиографическая ссылка
Кузнецова М.Г., Ушакова М.В., Гудинская Н.И., Николаев А.А. РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ЦИНКСОДЕРЖАЩЕЙ КАРБОАНГИДРАЗЫ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ САМЦОВ КРЫС // Современные проблемы науки и образования. – 2017. – № 2.;URL: http://сайт/ru/article/view?id=26215 (дата обращения: 19.07.2019).
Предлагаем вашему вниманию журналы, издающиеся в издательстве «Академия Естествознания»
Похожие статьи
