Úloha karboanhydrázy. Moderné problémy vedy a vzdelávania

Z venóznej krvi možno extrahovať 55-58 obj. % oxidu uhličitého. Väčšina CO2 extrahovaného z krvi pochádza zo solí kyseliny uhličitej prítomných v plazme a erytrocytoch a len asi 2,5 % obj. oxidu uhličitého sa rozpustí a asi 4 až 5 % obj. sa zlúči s hemoglobínom vo forme karbohemoglobínu.

Kyselina uhličitá vzniká z oxidu uhličitého v červených krvinkách, ktoré obsahujú enzým karboanhydráza, čo je silný katalyzátor, ktorý urýchľuje hydratačnú reakciu CO2.

Väzba oxidu uhličitého v krvi v kapilárach systémového kruhu. Oxid uhličitý vytvorený v tkanivách difunduje do krvi krvných kapilár, pretože napätie CO2 v tkanivách výrazne prevyšuje jeho napätie v arteriálnej krvi. CO2 rozpustený v plazme difunduje do červených krviniek, kde pod vplyvom karboanhydráza okamžite sa mení na kyselinu uhličitú,

Podľa výpočtov je aktivita karboanhydrázy v erytrocytoch taká, že reakcia hydratácie oxidu uhličitého sa zrýchli 1500-2000 krát. Keďže všetok oxid uhličitý vo vnútri erytrocytu sa premieňa na kyselinu uhličitú, napätie CO2 vo vnútri erytrocytu je takmer nulové, takže do erytrocytov vstupuje stále viac nových množstiev CO2. Vplyvom tvorby kyseliny uhličitej z CO3 v erytrocyte sa zvyšuje koncentrácia iónov HCO3", ktoré začnú difundovať do plazmy. Je to možné preto, že povrchová membrána erytrocytu je priepustná pre anióny. Pre katióny erytrocyt membrána je prakticky nepriepustná Namiesto iónov HCO3“ vstupuje ión erytrocytov do chlóru Prechod iónov chlóru z plazmy do erytrocytu uvoľňuje v plazme ióny sodíka, ktoré viažu ióny HCO3 vstupujúce do erytrocytu a tvoria NaHCO3 Chemický rozbor žilovej krvnej plazmy ukazuje významný nárast hydrogénuhličitanu v ňom.

Hromadenie aniónov vo vnútri erytrocytu vedie k zvýšeniu osmotického tlaku vo vnútri erytrocytu a to spôsobuje prechod vody z plazmy cez povrchovú membránu erytrocytu. V dôsledku toho sa zvyšuje objem červených krviniek v systémových kapilárach. Štúdia využívajúca hematokrit odhalila, že červené krvinky zaberajú 40 % objemu arteriálnej krvi a 40,4 % objemu venóznej krvi. Z toho vyplýva, že objem erytrocytov žilovej krvi je väčší ako objem arteriálnych erytrocytov, čo sa vysvetľuje prenikaním vody do nich.

Súčasne so vstupom CO2 do erytrocytu a tvorbou kyseliny uhličitej v ňom sa z oxyhemoglobínu uvoľňuje kyslík a mení sa na redukovaný hemoglobín. Posledne menovaná je oveľa menej disociačná kyselina ako oxyhemoglobín a kyselina uhličitá. Preto, keď sa oxyhemoglobín premení na hemoglobín, H2CO3 vytlačí draselné ióny z hemoglobínu a v kombinácii s nimi vytvorí draselnú soľ hydrogénuhličitanu.

Uvoľnený H˙ ión kyseliny uhličitej sa viaže na hemoglobín. Keďže znížený hemoglobín je mierne disociovaná kyselina, nedochádza k okysleniu krvi a rozdiel v pH medzi venóznou a arteriálnou krvou je extrémne malý. Reakciu vyskytujúcu sa v červených krvinkách tkanivových kapilár možno znázorniť takto:

KHbO2 + H2CO3 = HHb + O2 + KHS03

Z vyššie uvedeného vyplýva, že oxyhemoglobín, ktorý sa mení na hemoglobín a premieňa s ním spojené zásady na oxid uhličitý, podporuje tvorbu bikarbonátu a transport oxidu uhličitého v tejto forme. Okrem toho gcmoglobín tvorí s CO2 chemickú zlúčeninu – karbohemoglobín. Prítomnosť hemoglobínu a oxidu uhličitého v krvi bola stanovená nasledujúcim experimentom. Ak sa do plnej krvi pridá kyanid draselný, ktorý karboanhydrázu úplne inaktivuje, ukáže sa, že červené krvinky takejto krvi viažu viac CO2 ako plazma. Z toho sa usúdilo, že väzba CO2 erytrocytmi po inaktivácii karboanhydrázy sa vysvetľuje prítomnosťou zlúčeniny hemoglobínu s CO2 v erytrocytoch. Neskôr sa zistilo, že CO2 sa viaže na amínovú skupinu hemoglobínu a vytvára takzvanú karbamínovú väzbu.

Reakcia tvorby karbohemoglobínu môže ísť jedným alebo druhým smerom v závislosti od napätia oxidu uhličitého v krvi. Hoci malá časť celkového množstva oxidu uhličitého, ktoré je možné extrahovať z krvi, je kombinovaná s hemoglobínom (8-10%), úloha tejto zlúčeniny pri transporte oxidu uhličitého v krvi je dosť veľká. Približne 25-30% oxidu uhličitého absorbovaného krvou v systémových kapilárach sa spája s hemoglobínom za vzniku karbohemoglobínu.

Uvoľňovanie CO2 krvou v pľúcnych kapilárach. V dôsledku nižšieho parciálneho tlaku CO2 v alveolárnom vzduchu v porovnaní s jeho napätím vo venóznej krvi prechádza oxid uhličitý difúziou z krvi pľúcnych kapilár do alveolárneho vzduchu. Napätie CO2 v krvi klesá.

Zároveň v dôsledku vyššieho parciálneho tlaku kyslíka v alveolárnom vzduchu v porovnaní s jeho napätím vo venóznej krvi prúdi kyslík z alveolárneho vzduchu do krvi kapilár pľúc. Zvyšuje sa napätie O2 v krvi a hemoglobín sa premieňa na oxyhemoglobín. Keďže ide o kyselinu, ktorej disociácia je oveľa vyššia ako disociácia hemoglobínu kyseliny uhličitej, vytláča kyselinu uhličitú zo svojej draselnej kyseliny. Reakcia prebieha nasledovne:

ННb + O2 + KНSO3= KНbO2+H2CO3

Kyselina uhličitá, uvoľnená z väzby so zásadami, sa karboanhydrázou rozkladá na oxid uhličitý na vodu. Význam karboanhydrázy pri uvoľňovaní oxidu uhličitého v pľúcach možno vidieť z nasledujúcich údajov. Aby došlo k dehydratačnej reakcii H2CO3 rozpustenej vo vode, s vytvorením množstva oxidu uhličitého, ktorý opúšťa krv, kým je v pľúcnych kapilárach, trvá to 300 sekúnd. Krv prejde cez kapiláry pľúc v priebehu 1-2 sekúnd, ale počas tejto doby dôjde k dehydratácii kyseliny uhličitej vo vnútri červených krviniek a difúzii výsledného CO2 najskôr do krvnej plazmy a potom do alveolárneho vzduchu.

Keďže koncentrácia iónov HCO3 v erytrocytoch klesá v pľúcnych kapilárach, tieto ióny z plazmy začnú difundovať do erytrocytov a ióny chlóru difundujú z erytrocytov do plazmy. Vzhľadom na to, že napätie oxidu uhličitého v krvi pľúcnych kapilár klesá, štiepi sa karbamínová väzba a karbohemoglobín uvoľňuje oxid uhličitý.

Disociačné krivky zlúčenín kyseliny uhličitej v krvi. Ako sme už povedali, viac ako 85 % oxidu uhličitého, ktorý sa dá z krvi extrahovať okyslením, sa uvoľňuje v dôsledku rozkladu hydrogénuhličitanov (draslík v červených krvinkách a sodík v plazme).

Väzba oxidu uhličitého a jeho uvoľňovanie do krvi závisí od jeho čiastočného napätia. Je možné zostrojiť disociačné krivky pre zlúčeniny oxidu uhličitého v krvi, podobné disociačným krivkám pre oxyhemoglobín. Na tento účel sa na osi y vynesú objemové percentá oxidu uhličitého viazaného v krvi a na os x sa vynesú čiastočné napätia oxidu uhličitého. Spodná krivka na obr. 58 je znázornená väzba oxidu uhličitého arteriálnou krvou, ktorej hemoglobín je takmer úplne nasýtený kyslíkom. Horná krivka znázorňuje väzbu kyslého plynu žilovou krvou.

Rozdiel vo výške týchto kriviek závisí od toho, že arteriálna krv bohatá na oxyhemoglobín má v porovnaní s venóznou krvou nižšiu schopnosť viazať oxid uhličitý. Oxyhemoglobín, ktorý je silnejšou kyselinou ako kyselina uhličitá, odstraňuje zásady z hydrogénuhličitanov a tým prispieva k uvoľňovaniu kyseliny uhličitej. V tkanivách sa oxyhemoglobín, ktorý sa mení na hemoglobín, vzdáva zásad, ktoré sú s ním spojené, čím sa zvyšuje väzba kyslého plynu v krvi.

Bod A na spodnej krivke na obr. 58 zodpovedá napätiu kyseliny 40 mm Hg. Art., teda napätie, ktoré skutočne existuje v arteriálnej krvi. Pri tomto napätí je viazaných 52 obj.% CO2. Bod V na hornej krivke zodpovedá napätiu kyslého plynu 46 mmHg. Art., teda skutočne prítomný v žilovej krvi. Ako je zrejmé z krivky, pri tomto napätí viaže venózna krv 58 obj. % oxidu uhličitého. AV čiara spájajúca hornú a dolnú krivku zodpovedá tým zmenám v schopnosti viazať oxid uhličitý, ku ktorým dochádza pri premene arteriálnej krvi na venóznu alebo naopak venóznej krvi na arteriálnu.

Venózna krv tým, že hemoglobín, ktorý obsahuje, sa mení na oxyhemoglobín, uvoľňuje v pľúcnych kapilárach asi 6 obj.% CO2. Ak by sa hemoglobín v pľúcach nepremenil na oxyhemoglobín, potom, ako je zrejmé z krivky, žilová krv s parciálnym tlakom oxidu uhličitého v alveolách rovným 40 mm Hg. Čl. by viazal 54 obj.% CO2, teda vzdal by sa nie 6, ale len 4 obj.%. Podobne, ak sa arteriálna krv v kapilárach systémového kruhu nevzdala svojho kyslíka, to znamená, ak jej hemoglobín zostal nasýtený kyslíkom, potom táto arteriálna krv pri parciálnom tlaku oxidu uhličitého prítomného v kapilárach tela tkanivách, by nedokázala viazať 58 obj. .% CO2, ale len 55 obj.

Karboanhydráza(synonymum: karbonátdehydratáza, karbonáthydrolyáza) je enzým, ktorý katalyzuje reverzibilnú reakciu hydratácie oxidu uhličitého: CO 2 + H 2 O Û H 2 CO 3 Û H + + HCO 3. Obsiahnuté v červených krvinkách, bunkách žalúdočnej sliznice, kôre nadobličiek, obličkách av malom množstve aj v centrálnom nervovom systéme, pankrease a iných orgánoch. Úloha karboanhydrázy v tele je spojená s udržiavaním acidobázická rovnováha, transport CO 2, tvorba kyseliny chlorovodíkovej sliznicou žalúdka. Aktivita karboanhydrázy v krvi je normálne pomerne konštantná, ale pri niektorých patologických stavoch sa dramaticky mení. Zvýšenie aktivity karboanhydrázy v krvi sa pozoruje pri anémii rôzneho pôvodu, poruchách krvného obehu stupňa II-III, niektorých pľúcnych ochoreniach (bronchiektázia, pneumoskleróza), ako aj počas tehotenstva. Zníženie aktivity tohto enzýmu v krvi nastáva pri acidóze renálneho pôvodu, hypertyreóze. Pri intravaskulárnej hemolýze sa aktivita karboanhydrázy objavuje v moči, zatiaľ čo normálne chýba. Pri chirurgických zákrokoch na srdci a pľúcach je vhodné sledovať aktivitu karboanhydrázy v krvi, pretože môže slúžiť ako indikátor adaptačných schopností organizmu, ako aj pri terapii inhibítormi karboanhydrázy - hypotiazidom, diakarbom.

Na stanovenie aktivity karboanhydrázy sa používajú rádiologické, imunoelektroforetické, kolorimetrické a titrimetrické metódy. Stanovenie sa robí v plnej krvi odobratej s heparínom alebo v hemolyzovaných červených krvinkách. Pre klinické účely sú najprijateľnejšie kolorimetrické metódy na stanovenie aktivity karboanhydrázy (napríklad modifikácie Brinkmanovej metódy), založené na stanovení času potrebného na posun pH inkubačnej zmesi z 9,0 na 6,3 v dôsledku hydratácie CO 2 . . Voda nasýtená oxidom uhličitým sa zmieša s roztokom indikátorového pufra a určitým množstvom krvného séra (0,02 ml) alebo suspenzia hemolyzovaných erytrocytov. Ako indikátor sa používa fenolová červeň. Keď sa molekuly kyseliny uhličitej disociujú, všetky nové molekuly CO 2 podliehajú enzymatickej hydratácii. Na získanie porovnateľné výsledky reakcia musí prebiehať vždy pri rovnakej teplote, najvýhodnejšie je udržiavať teplotu topiaceho sa ľadu na 0°. Kontrolný reakčný čas (spontánna reakcia hydratácie CO2) je normálne 110-125 s. Normálne je aktivita karboanhydrázy pri stanovení touto metódou v priemere 2 – 2,5 konvenčných jednotiek a v prepočte na 1 milión červených krviniek je to 0,458 ± 0,006 konvenčných jednotiek (jednotka aktivity karboanhydrázy sa považuje za 2-násobné zvýšenie rýchlosti katalyzovanej reakcie).

Bibliografia: Klinické hodnotenie laboratórnych testov, vyd. NO. Titsa, per. z angličtiny, s. 196, M., 1986.

Karboanhydráza(synonymum: karbonátdehydratáza, karbonáthydrolyáza) je enzým, ktorý katalyzuje reverzibilnú reakciu hydratácie oxidu uhličitého: CO 2 + H 2 O Û H 2 CO 3 Û H + + HCO 3. Obsiahnuté v červených krvinkách, bunkách žalúdočnej sliznice, kôre nadobličiek, obličkách av malom množstve aj v centrálnom nervovom systéme, pankrease a iných orgánoch. Úloha K. v organizme je spojená s udržiavaním acidobázickej rovnováhy, transport CO 2, tvorba kyseliny chlorovodíkovej sliznicou žalúdka. Aktivita K. v krvi je za normálnych okolností celkom konštantná, ale pri niektorých patologických stavoch sa prudko mení. Zvýšenie aktivity K. v krvi sa pozoruje v prípadoch rôzneho pôvodu, obehových porúch stupňa II-III, niektorých pľúcnych ochorení (bronchiektázie, pneumosklerózy), ako aj počas tehotenstva. Zníženie aktivity tohto enzýmu v krvi nastáva pri acidóze obličkového pôvodu, hypertyreóze. Pri intravaskulárnej hemolýze sa aktivita K. objavuje v moči, zatiaľ čo normálne chýba.

Pri chirurgických zákrokoch na srdci a pľúcach je vhodné sledovať aktivitu K. v krvi, pretože môže slúžiť ako indikátor adaptačných schopností organizmu, ako aj pri terapii inhibítormi karboanhydrázy - hypotiazidom, diakarbom.

modifikácie Brinkmanovej metódy), založené na stanovení času potrebného na posun pH inkubačnej zmesi z 9,0 na 6,3 v dôsledku hydratácie CO2. Voda nasýtená oxidom uhličitým sa zmieša s roztokom indikátorového pufra a určitým množstvom krvného séra (0,02 ml) alebo suspenzia hemolyzovaných erytrocytov. Ako indikátor sa používa fenolová červeň. Keď sa molekuly kyseliny uhličitej disociujú, všetky nové molekuly CO 2 podliehajú enzymatickej hydratácii. Aby sa dosiahli porovnateľné výsledky, reakcia by mala vždy prebiehať pri rovnakej teplote, najvýhodnejšie je udržiavať teplotu topiaceho sa ľadu na 0 °C. Kontrolný reakčný čas (spontánna reakcia hydratácie CO2) je normálne 110-125 s. Bežne sa aktivita K. pri stanovení touto metódou rovná v priemere 2 – 2,5 konvenčným jednotkám a v prepočte na 1 milión červených krviniek 0,458 ± 0,006 konvenčných jednotiek (jednotka aktivity K. sa berie je to 2-násobné zvýšenie rýchlosti katalyzovanej reakcie).

Bibliografia: Klinické hodnotenie laboratórnych testov, vyd. NO. Titsa, per. z angličtiny, s. 196, M., 1986.

ja Karboanhydráza (synonymum: karbonátdehydratáza, karbonáthydrolyáza)

enzým, ktorý katalyzuje reverzibilnú hydratačnú reakciu oxidu uhličitého: CO 2 + H 2 O ⇔ H 2 CO 3 ⇔ H + + HCO 3. Obsiahnuté v červených krvinkách, bunkách žalúdočnej sliznice, kôre nadobličiek, obličkách av malom množstve aj v centrálnom nervovom systéme, pankrease a iných orgánoch. Úloha kyseliny v tele je spojená s udržiavaním acidobázickej rovnováhy (acidobázická rovnováha) , transport CO 2, tvorba kyseliny chlorovodíkovej sliznicou žalúdka. Aktivita K. v krvi je za normálnych okolností celkom konštantná, ale pri niektorých patologických stavoch sa prudko mení. Zvýšenie aktivity K. v krvi sa pozoruje pri anémii rôzneho pôvodu, poruchách krvného obehu II-III stupňa, niektorých pľúcnych ochoreniach (bronchiektázia, pneumoskleróza), ako aj počas tehotenstva. Zníženie aktivity tohto enzýmu v krvi nastáva pri acidóze renálneho pôvodu, hypertyreóze. Pri intravaskulárnej hemolýze sa aktivita K. objavuje v moči, zatiaľ čo normálne chýba. Pri chirurgických zákrokoch na srdci a pľúcach je vhodné sledovať aktivitu K. v krvi, pretože môže slúžiť ako indikátor adaptačných schopností organizmu, ako aj pri terapii inhibítormi karboanhydrázy - hypotiazidom, diakarbom.

Na stanovenie aktivity K. sa používajú rádiologické, imunoelektroforetické, kolorimetrické a titrimetrické metódy. Stanovenie sa robí v plnej krvi odobratej s heparínom alebo v hemolyzovaných červených krvinkách. Na klinické účely sú najprijateľnejšie kolorimetrické metódy na stanovenie aktivity K (napríklad modifikácie Brinkmanovej metódy), založené na stanovení času potrebného na posun pH inkubačnej zmesi z 9,0 na 6,3 v dôsledku hydratácie CO2. Voda nasýtená oxidom uhličitým sa zmieša s roztokom indikátorového pufra a určitým množstvom krvného séra (0,02 ml) alebo suspenzia hemolyzovaných erytrocytov. Ako indikátor sa používa fenolová červeň. Keď sa molekuly kyseliny uhličitej disociujú, všetky nové molekuly CO 2 podliehajú enzymatickej hydratácii. Aby sa dosiahli porovnateľné výsledky, reakcia by mala vždy prebiehať pri rovnakej teplote, najvýhodnejšie je udržiavať teplotu topiaceho sa ľadu na 0 °C. Kontrolný reakčný čas (spontánna reakcia hydratácie CO2) je normálne 110-125 s. Bežne sa aktivita K. pri stanovení touto metódou rovná v priemere 2 – 2,5 konvenčným jednotkám a v prepočte na 1 milión červených krviniek 0,458 ± 0,006 konvenčných jednotiek (jednotka aktivity K. sa berie je to 2-násobné zvýšenie rýchlosti katalyzovanej reakcie).

Bibliografia: Klinické hodnotenie laboratórnych testov, vyd. NO. Titsa, per. z angličtiny, s. 196, M., 1986.

II Karboanhydráza

- enzým, ktorý katalyzuje vratnú reakciu vzniku kyseliny uhličitej z oxidu uhličitého a vody. Inhibítory K sa používajú v medicíne na liečbu niektorých kardiovaskulárnych a iných ochorení...
Prírodná veda. encyklopedický slovník
- I Karboanhydráza je enzým, ktorý katalyzuje reverzibilnú reakciu hydratácie oxidu uhličitého: CO2 + H2O ⇔ H2CO3 ⇔ H+ + HCO3...
Lekárska encyklopédia
- zinok obsahujúci enzým skupiny uhlík-kyslík lyáza, katalyzujúci reverzibilnú reakciu štiepenia kyseliny uhličitej na oxid uhličitý a vodu...
Veľký lekársky slovník
- karboanhydráza, karbonáthydrolyáza, enzým triedy lyáz, katalyzujúci reverzibilnú tvorbu kyseliny uhličitej z oxidu uhličitého a vody: CO2 + H2O ↔ H2CO3. K. je metaloproteín obsahujúci Zn...

Cieľom práce je zistiť faktory ovplyvňujúce aktivitu karboanhydrázy obsahujúcej zinok v reprodukčnom systéme samcov potkanov v podmienkach expozície mikrovlnnému žiareniu nízkej intenzity. Karboanhydráza hrá dôležitú úlohu v metabolizme semennej plazmy a dozrievaní spermií. Aktivita karboanhydrázy vo vodno-soľných extraktoch nadsemenníkov a semenníkov potkanov v kontrolnej skupine sa podľa našich údajov pohybuje v rozmedzí od 84,0 ± 74,5 U/ml, čo je z hľadiska hmotnosti tkaniva 336,0 ± 298,0 U/mg. Študoval sa vzťah medzi koncentráciou zinkových a polyamínových iónov a aktivitou karboanhydrázy. Aktivita karboanhydrázy v reprodukčnom systéme samcov potkanov má komplexnú regulačnú schému, ktorá samozrejme nie je obmedzená na faktory, ktoré sme opísali. Na základe získaných výsledkov možno usúdiť, že úloha rôznych regulátorov aktivity tohto enzýmu sa mení v závislosti od stupňa aktivity karboanhydrázy. Vzhľadom na údaje o funkciách tohto polyamínu je pravdepodobné, že vysoké koncentrácie spermínu obmedzujú transkripciu génu karboanhydrázy. Spermidín pravdepodobne slúži ako limitujúci faktor v posttribozomálnych štádiách regulácie aktivity karboanhydrázy a putrescín a koncentrácia iónov zinku sú vzájomne prepojené aktivačné faktory.

reprodukčný systém samcov potkanov

koncentrácia iónov zinku

polyamíny

karboanhydráza

1. Bojko O.V. Metodologické aspekty použitia kyseliny chlorovodíkovej spermínu a spermidínu na identifikáciu uropatogénnej mikroflóry / O.V. Bojko, A.A. Terentyev, A.A. Nikolaev // Problémy s reprodukciou. – 2010. – Číslo 3. – S. 77-79.

2. Ilyina O.S. Zmeny obsahu zinku v ľudskej krvi pri diabetes mellitus typu I a vlastnosti hypoglykemického účinku komplexu inzulín-chondroitín sulfát obsahujúci zinok: abstrakt. dis. ...sladkosti. biol. Sci. – Ufa, 2012. – 24 s.

3. Lucky D.L. Proteínové spektrum ejakulátov rôznej plodnosti / D.L. Lucky, A.A. Nikolaev, L.V. Lozhkina // Urológia. – 1998. – Číslo 2. – S. 48-52.

4. Nikolaev A.A. Aktivita spermoplazmatických enzýmov v ejakulátoch rôznej plodnosti / A.A. Nikolaev, D.L. Lucky, V.A. Bochanovský, L.V. Lozhkina // Urológia. – 1997. – Číslo 5. – S. 35.

5. Ploskonos M.V. Stanovenie polyamínov v rôznych biologických objektoch / M.V. Ploskonos, A.A. Nikolaev, A.A. Nikolaev // Štát Astrachán. med. akad. – Astrachaň, 2007. – 118 s.

6. Polunin A.I. Použitie zinku pri liečbe mužskej subfertility / A.I. Polunin, V.M. Miroshnikov, A.A. Nikolaev, V.V. Dumčenko, D.L. Lutsky // Mikroelementy v medicíne. – 2001. – T. 2. – č. 4. – S. 44-46.

7. Haggis G.C., Gortos K. Karboanhydrázová aktivita tkanív reprodukčného traktu samcov potkanov a jej vzťah k produkcii spermy // J. Fert. Reprod. – 2014. - V. 103. - S. 125-130.

Je známe, že aktivita karboanhydrázy obsahujúcej zinok je vysoká v reprodukčnom systéme samcov vtákov, cicavcov a ľudí. Aktivita tohto enzýmu ovplyvňuje dozrievanie spermií, ich počet a objem spermií. Neexistujú však informácie o zmenách v aktivite karboanhydrázy pod vplyvom iných stálych zložiek reprodukčného systému, ako sú ióny zinku a polyamíny (putrescín, spermín a spermidín), ktoré aktívne ovplyvňujú spermatogenézu. Iba dané všeobecné charakteristiky dôsledky zmien v aktivite karboanhydrázy na morfofunkčný stav orgánov reprodukčného systému samcov potkanov, počet spermií, ich pohyblivosť.

Účel našej práce bola štúdia aktivity karboanhydrázy obsahujúcej zinok a jej vzťahu s hladinou polyamínov a iónov zinku v tkanive reprodukčného systému dospelých samcov potkanov.

Materiály a metódy. Experimentálna časť štúdie zahŕňala 418 samcov albínskych potkanov Wistar. Potkany boli vo veku 6-7 mesiacov (zrelé jedince). Telesná hmotnosť potkanov bola 180-240 g, udržiavané za štandardných podmienok vivária. Aby sa predišlo vplyvu sezónnych rozdielov v reakciách na experimentálne vplyvy, všetky štúdie sa uskutočnili v jesenno-zimnom období roka. Odber semenníkov a nadsemenníkov od potkanov sa uskutočnil v éterovej anestézii ( experimentálne štúdie sa uskutočnili v prísnom súlade s Helsinskou deklaráciou o humánnom zaobchádzaní so zvieratami).

Predmetom našej štúdie boli vodno-solné extrakty z nadsemenníkov a semenníkov pohlavne zrelých samcov bielych potkanov. Extrakty boli pripravené v pufri Tris-kyselina chlorovodíková pH = 7,6 v pomere hmotnosť/objem 1/5, po štvornásobnom zmrazení, rozmrazení a centrifugácii pri 8000 g počas 50 minút boli vzorky zmrazené a uskladnené pri -24 °C do štúdium.

Stanovenie zinku. K 2 ml skúmaného extraktu sa pridalo 0,1 ml 10 % NaOH a 0,2 ml 1 % roztoku ditizónu v tetrachlórmetáne. V negatívnej kontrole sa pridali 2 ml destilovanej vody, v pozitívnej kontrole - 2 ml 20 μmol roztoku síranu zinočnatého (molárna koncentrácia štandardného roztoku síranu zinočnatého). Vzorky boli merané pri 535 nm. Koncentrácia katiónov zinku vo vzorke sa vypočítala pomocou vzorca: CZn=20 umol x Vzorka OD535/Štandardná OD535, kde Vzorka OD535 je optická hustota vzorky, meraná pri 535 nm; OD535 štandard - optická hustota štandardného 20 mikromolárneho roztoku síranu zinočnatého, meraná pri 535 nm.

Stanovenie karboanhydrázy. Metóda je založená na reakcii dehydratácie hydrogénuhličitanu s odstránením oxidu uhličitého vzniknutého v dôsledku dehydratácie s intenzívnym prebublávaním reakčného média vzduchom zbaveným oxidu uhoľnatého a súčasným zaznamenávaním rýchlosti zmeny pH. Reakcia sa iniciuje rýchlym zavedením roztoku substrátu - hydrogénuhličitanu sodného (10 mM) do reakčnej zmesi obsahujúcej testovanú vzorku. V tomto prípade sa pH zvýši o 0,01-0,05 jednotiek. Vzorky (10,0-50,0 mg) nadsemenníkov a semenníkov pohlavne dospelých samcov bielych potkanov sa homogenizovali a centrifugovali pri 4500 g počas 30 minút. pri 4 °C a supernatant sa zriedi dvakrát destilovanou vodou pri 4 °C na objem, ktorý umožní meranie reakčného času. Aktivita karboanhydrázy je určená zmenou počiatočnej hodnoty pH z 8,2 na 8,7 pri dehydratačnej reakcii CO2. Rýchlosť akumulácie hydroxylových iónov sa meria elektrometricky pomocou citlivého programovateľného pH metra (InoLab pH 7310) prepojeného s PC. Posun pH z 8,2 na 8,7 ako funkcia času v lineárnom reze zohľadňuje aktivitu enzýmu. Vypočítal sa priemerný čas (T) pre 4 merania. Ako kontrola bola braná doba zmeny pH počas spontánnej hydratácie CO2 v médiu bez vzorky. Aktivita karboanhydrázy bola vyjadrená v enzýmových jednotkách (U) na mg vlhkého tkaniva podľa rovnice: ED = 2 (T0 - T)/ (T0 × mg tkaniva v reakčnej zmesi), kde T0 = priemerný čas pre 4 merania čistý roztok 4 ml ochladenej, nasýtenej dvakrát destilovanej vody oxidu uhličitého.

Stanovenie polyamínov. Vzorky (100–200 mg) nadsemenníkov a semenníkov dospelých samcov albínov potkanov sa homogenizovali, suspendovali v 1 ml 0,2 normálnej kyseliny chloristej, aby sa extrahovali voľné polyamíny, a odstredili sa. Do 100 μl supernatantu sa pridalo 110 μl 1,5 M uhličitanu sodného a 200 μl dansylchloridu (7,5 mg/ml roztok v acetóne; Sigma, Mníchov, Nemecko). Okrem toho sa pridalo 10 ul 0,5 mM diaminohexánu ako vnútorného štandardu. Po 1 hodine inkubácie pri 60 °C v tme sa pridalo 50 μl roztoku prolínu (100 mg/ml), aby sa naviazal voľný dansylchlorid. Potom sa dansylové deriváty polyamínov (ďalej označované ako DNSC-polyamíny) extrahovali toluénom, sublimovali vo vákuovej odparke a rozpustili v metanole. Chromatografia sa uskutočnila na kolóne LC 18 s reverznou fázou (Supelco), vo vysokovýkonnom systéme kvapalinovej chromatografie (Dionex) pozostávajúcom z gradientového mixéra (model P 580), automatického injektora (ASI 100) a fluorescenčného detektora (RF 2000). . Polyamíny boli eluované v lineárnom gradiente od 70 % do 100 % (v/v) metanolu vo vode pri prietokovej rýchlosti 1 ml/min a detegované pri excitačnej vlnovej dĺžke 365 nm a emisnej vlnovej dĺžke 510 nm. Údaje boli analyzované pomocou softvér Dionex Chromeleon a kvantifikácia bola uskutočnená pomocou kalibračných kriviek získaných zo zmesi čistých látok (obr. A).

Vysokoúčinná chromatografia DNSC polyamínov:

A - chromatogram štandardnej zmesi DNSC-polyamínov; B - chromatogram DNSC-polyamínov z jednej zo vzoriek tkaniva nadsemenníka a semenníkov samcov potkanov. 1 - putrescín; 2 - kadaverín; 3 - hexándiamín (vnútorný štandard); 4 - spermidín; 5 - spermie. Na osi x je čas v minútach, na osi y je fluorescencia. Nečíslované vrcholy - neidentifikované nečistoty

Výsledky výskumu a diskusia. Ako je známe, karboanhydráza hrá dôležitú úlohu v metabolizme semennej plazmy a dozrievaní spermií. Aktivita karboanhydrázy vo vodno-soľných extraktoch nadsemenníkov a semenníkov potkanov v kontrolnej skupine sa podľa našich údajov pohybuje v rozmedzí od 84,0 ± 74,5 U/ml, čo je z hľadiska hmotnosti tkaniva 336,0 ± 298,0 U/mg. Takúto vysokú aktivitu enzýmu možno vysvetliť jeho dôležitou fyziologickou úlohou. Pre porovnanie, úroveň aktivity tohto enzýmu v iných tkanivách tých istých zvierat je oveľa nižšia (tabuľka 1), s výnimkou plnej krvi, v ktorej je známa vysoká aktivita karboanhydrázy erytrocytov. Pozoruhodný je však veľmi široký rozptyl hodnôt aktivity karboanhydrázy v nadsemenníkoch a semenníkoch, ktorých variačný koeficient je viac ako 150 % (tabuľka 1).

stôl 1

Aktivita karboanhydrázy v tkanivách sexuálne zrelých mužov

Tkanivo samcov potkanov	Enzýmová aktivita, jednotky	Počet pozorovaní	Variačný koeficient, %


mozgového tkaniva
Svalovina
Sliznica gastrointestinálneho traktu
nadsemenníky a semenníky
Plná krv

To naznačuje vplyv nezohľadnených faktorov na aktivitu enzýmu. Túto vlastnosť vysvetľujú dve okolnosti. Po prvé, je známe, že biologicky aktívne amíny, vrátane polyamínov spermidín a spermín, sú schopné aktivovať karboanhydrázu. Práve mužský reprodukčný systém je najbohatším zdrojom spermínu a spermidínu. Preto sme sa držali paralelná definícia koncentrácie polyamínov vo vodno-solných extraktoch nadsemenníkov a semenníkov samcov potkanov. Polyamíny spermidín, spermín a putrescín sa analyzovali pomocou HPLC, ako je opísané v časti Metódy. Ukázalo sa, že spermín, spermidín a putrescín boli detegované v tkanive nadsemenníkov a semenníkov samcov potkanov (obr. B).

U zdravých pohlavne dospelých samcov potkanov bola hladina spermínu 5,962±4,0,91 µg/g tkaniva, spermidínu 3,037±3,32 µg/g tkaniva, putrescínu 2,678±1,82 µg/g tkaniva a pomer spermín/spermidín 1,88-2 Navyše, podľa našich údajov hladina spermidínu aj hladina spermínu (v menšej miere) podlieha výrazným výkyvom. Korelačná analýza ukázala významný pozitívny vzťah (r=+0,3) medzi hladinami spermínu a spermidínu, respektíve spermidínu a putrescínu (r=+0,42). Táto okolnosť je zrejme jedným z faktorov ovplyvňujúcich vysoký rozptyl výsledkov stanovenia aktivity karboanhydrázy.

Ďalším regulátorom aktivity karboanhydrázy môže byť hladina zinku v reprodukčnom tkanive pohlavne dospelých samcov potkanov. Podľa našich údajov sa hladina iónu zinku značne líši, od 3,2 do 36,7 μg/g tkaniva celkového preparátu semenníkov a nadsemenníkov pohlavne dospelých samcov potkanov.

Korelačná analýza hladín zinku s hladinami aktivity spermínu, spermidínu a karboanhydrázy ukázala rôzne úrovne pozitívnej korelácie medzi koncentráciou iónov zinku a týchto metabolitov. So spermínom sa zistila nevýznamná úroveň asociácie (+0,14). Vzhľadom na počet použitých pozorovaní táto korelácia nie je významná (p≥0,1). Významná pozitívna korelácia bola zistená medzi hladinou iónov zinku a koncentráciou putrescínu (+0,42) a koncentráciou spermidínu (+0,39). Očakávaná vysoká pozitívna korelácia (+0,63) bola zistená aj medzi koncentráciou iónov zinku a aktivitou karboanhydrázy.

V ďalšej fáze sme sa pokúsili skombinovať koncentráciu zinku a hladinu polyamínov ako faktorov regulujúcich aktivitu karboanhydrázy. Pri analýze radu variácií spoločného stanovenia koncentrácie iónov zinku, polyamínov a aktivity karboanhydrázy sa odhalili určité zákonitosti. Ukázalo sa, že zo 69 štúdií vykonaných na úrovni aktivity karboanhydrázy možno rozlíšiť tri skupiny:

Skupina 1 - vysoká aktivita od 435 do 372 jednotiek (počet pozorovaní 37),

Skupina 2 - nízka aktivita od 291 do 216 jednotiek (počet pozorovaní 17),

Skupina 3 - veľmi nízka aktivita od 177 do 143 jednotiek (počet pozorovaní 15).

Pri klasifikácii hladín polyamínov a koncentrácie iónov zinku s týmito skupinami sa odhalil zaujímavý znak, ktorý sa pri analýze série variácií neobjavil. Maximálne koncentrácie spermínu (v priemere 9,881±0,647 μg/g tkaniva) sú spojené s treťou skupinou pozorovaní s veľmi nízkou aktivitou karboanhydrázy a minimálne (v priemere 2,615±1,130 μg/g tkaniva) s druhou skupinou s nízkou enzýmová aktivita.

Najväčší počet pozorovaní je spojený s prvou skupinou s vysoký stupeň aktivita karboanhydrázy, v tejto skupine sú koncentrácie spermínu blízke priemerným hodnotám (v priemere 4,675 ± 0,725 μg/g tkaniva).

Koncentrácia iónov zinku vykazuje komplexný vzťah s aktivitou karboanhydrázy. V prvej skupine aktivity karboanhydrázy (tabuľka 2) je aj koncentrácia iónov zinku vyššia ako hodnoty v ostatných skupinách (v priemere 14,11±7,25 μg/g tkaniva). Ďalej, koncentrácia iónov zinku klesá v súlade s poklesom aktivity karboanhydrázy, ale tento pokles nie je úmerný. Ak v druhej skupine poklesne aktivita karboanhydrázy oproti prvej o 49,6 % a v tretej o 60,35 %, potom koncentrácia iónov zinku klesne v druhej skupine o 23 % a v tretej o 39 %.

tabuľka 2

Vzťah medzi koncentráciou polyamínov a iónov zinku a aktivitou karboanhydrázy

Skupiny aktivít karboanhydráza, jednotky	Priemerná koncentrácia spermín, ug/g tkaniva	Priemerná koncentrácia spermidín, ug/g tkaniva	Priemerná koncentrácia putrescín, µg/g tkaniva	Priemerná koncentrácia ióny zinku, µg/g tkaniva

To naznačuje ďalšie faktory ovplyvňujúce aktivitu tohto enzýmu. Dynamika koncentrácie putrescínu vyzerá trochu inak (tabuľka 2). Hladina tohto polyamínu klesá rýchlejším tempom a v tretej porovnávacej skupine je hladina putrescínu nižšia v priemere o takmer 74 %. Dynamika hladín spermidínu sa líši v tom, že „vyskakujúce“ hodnoty koncentrácie tohto polyamínu sú spojené predovšetkým s druhou skupinou úrovní aktivity karboanhydrázy. Pri vysokej aktivite tohto enzýmu (skupina 1) je koncentrácia spermidínu o niečo vyššia ako priemer zo všetkých pozorovaní a v tretej skupine je takmer 4-krát nižšia ako koncentrácia v druhej skupine.

Aktivita karboanhydrázy v reprodukčnom systéme samcov potkanov má teda komplexnú regulačnú schému, ktorá samozrejme nie je obmedzená na faktory, ktoré sme opísali. Na základe získaných výsledkov možno usúdiť, že úloha rôznych regulátorov aktivity tohto enzýmu sa mení v závislosti od stupňa aktivity karboanhydrázy. Vzhľadom na údaje o funkciách tohto polyamínu je pravdepodobné, že vysoké koncentrácie spermínu obmedzujú transkripciu génu karboanhydrázy. Spermidín pravdepodobne slúži ako limitujúci faktor v posttribozomálnych štádiách regulácie aktivity karboanhydrázy a putrescín a koncentrácia iónov zinku sú vzájomne prepojené aktivačné faktory.

Za týchto podmienok sa hodnotenie vplyvu vonkajších faktorov (vrátane tých, ktoré menia reprodukčnú funkciu) na aktivitu karboanhydrázy, ako jedného z dôležitých článkov v metabolizme reprodukčného systému samcov cicavcov, stáva nielen dôležitým, ale aj pomerne zložitý proces, ktorý si vyžaduje veľký počet kontrol a mnohostranné hodnotenie.

Bibliografický odkaz

Kuznetsova M.G., Ushakova M.V., Gudinskaya N.I., Nikolaev A.A. REGULÁCIA AKTIVITY KARBONANHYDRÁZY OBSAHUJÚCE ZINOK V REPRODUKČNEJ SÚSTAVE POKRÝSNYCH SAMČOV // Súčasné problémy veda a vzdelanie. – 2017. – č. 2.;
URL: http://site/ru/article/view?id=26215 (dátum prístupu: 19.07.2019).