Karbonsyraanhydras roll. Moderna problem med vetenskap och utbildning

55-58 vol.% koldioxid kan extraheras från venöst blod. Det mesta av CO2 som extraheras från blodet kommer från kolsyrasalter som finns i plasma och erytrocyter, och endast cirka 2,5 vol.% koldioxid löses upp och cirka 4-5 vol.% kombineras med hemoglobin i form av karbohemoglobin.

Kolsyra bildas av koldioxid i röda blodkroppar, som innehåller enzymet kolsyraanhydras, som är en kraftfull katalysator som påskyndar hydreringsreaktionen av CO2.

Bindning av koldioxid i blodet i kapillärerna i den systemiska cirkeln. Koldioxid som bildas i vävnaderna diffunderar in i blodet i blodkapillärerna, eftersom CO2-spänningen i vävnaderna avsevärt överstiger dess spänning i artärblodet. CO2 löst i plasma diffunderar in i de röda blodkropparna, där under påverkan kolsyraanhydras det förvandlas omedelbart till kolsyra,

Enligt beräkningar är aktiviteten av kolsyraanhydras i erytrocyter sådan att reaktionen av koldioxidhydratisering accelereras med 1500-2000 gånger. Eftersom all koldioxid inuti erytrocyten omvandlas till kolsyra är CO2-spänningen inuti erytrocyten nära noll, så fler och fler nya mängder CO2 kommer in i erytrocyten. På grund av bildningen av kolsyra från CO3 i erytrocyten ökar koncentrationen av HCO3"-joner, och de börjar diffundera in i plasman. Detta är möjligt eftersom erytrocytens ytmembran är permeabelt för anjoner. För katjoner är erytrocyten membranet är praktiskt taget ogenomträngligt. Istället för HCO3"-joner kommer erytrocytjonen in i klor Övergången av klorjoner från plasman till erytrocyten frigör natriumjoner i plasman, som binder HCO3-jonerna som kommer in i erytrocyten och bildar NaHCO3. Kemisk analys av venös blodplasma visar en signifikant ökning av bikarbonat i den.

Ansamlingen av anjoner inuti erytrocyten leder till en ökning av osmotiskt tryck inuti erytrocyten, och detta orsakar passage av vatten från plasman genom erytrocytens ytmembran. Som ett resultat ökar volymen av röda blodkroppar i de systemiska kapillärerna. En studie med hematokrit visade att röda blodkroppar upptar 40 % av volymen artärblod och 40,4 % av volymen venöst blod. Det följer av detta att volymen av venösa bloderytrocyter är större än för arteriella erytrocyter, vilket förklaras av att vatten tränger in i dem.

Samtidigt som CO2 kommer in i erytrocyten och bildandet av kolsyra i den frigörs syre från oxyhemoglobin och omvandlas till reducerat hemoglobin. Den senare är en mycket mindre dissocierande syra än oxyhemoglobin och kolsyra. Därför, när oxihemoglobin omvandlas till hemoglobin, tränger H2CO3 undan kaliumjoner från hemoglobin och bildar i kombination med dem kaliumsaltet av bikarbonat.

Den frigjorda H˙-jonen av kolsyra binder till hemoglobin. Eftersom reducerat hemoglobin är en lätt dissocierad syra sker ingen försurning av blodet och skillnaden i pH mellan venöst och arteriellt blod är extremt liten. Reaktionen som inträffar i de röda blodkropparna i vävnadskapillärer kan representeras enligt följande:

KHbO2 + H2CO3= HHb + O2 + KHS03

Av ovanstående följer att oxyhemoglobin, som omvandlas till hemoglobin och ger upp baserna som är associerade med det till koldioxid, främjar bildningen av bikarbonat och transporten av koldioxid i denna form. Dessutom bildar gcmoglobin en kemisk förening med CO2 - karbohemoglobin. Närvaron av hemoglobin och koldioxid i blodet bestämdes genom följande experiment. Om kaliumcyanid tillsätts till helblod, vilket helt inaktiverar kolsyraanhydras, visar det sig att de röda blodkropparna i sådant blod binder mer CO2 än plasma. Av detta drogs slutsatsen att bindningen av CO2 av erytrocyter efter inaktivering av kolsyraanhydras förklaras av närvaron av en hemoglobinförening med CO2 i erytrocyter. Senare upptäcktes att CO2 binder sig till amingruppen i hemoglobin och bildar en så kallad karbaminbindning.

Reaktionen av karbohemoglobinbildning kan gå åt ena eller andra hållet beroende på spänningen av koldioxid i blodet. Även om en liten del av den totala mängden koldioxid som kan extraheras från blodet kombineras med hemoglobin (8-10%), är denna förenings roll i transporten av koldioxid i blodet ganska stor. Cirka 25-30 % av den koldioxid som absorberas av blodet i de systemiska kapillärerna kombineras med hemoglobin för att bilda karbohemoglobin.

Frisättning av CO2 genom blod i lungkapillärerna. På grund av det lägre partialtrycket av CO2 i alveolluften jämfört med dess spänning i det venösa blodet, passerar koldioxid genom diffusion från blodet i lungkapillärerna till alveolluften. CO2-spänningen i blodet sjunker.

Samtidigt, på grund av det högre partialtrycket av syre i alveolluften jämfört med dess spänning i det venösa blodet, strömmar syre från alveolluften in i blodet i lungornas kapillärer. O2-spänningen i blodet ökar, och hemoglobin omvandlas till oxyhemoglobin. Eftersom den senare är en syra, vars dissociation är mycket högre än den för kolsyrahemoglobin, tränger den bort kolsyra från sin kaliumsyra. Reaktionen går som följer:

ННb + O2 + KНSO3= KНbO2+H2CO3

Kolsyra, befriad från sin bindning med baser, bryts ned av kolsyraanhydras till koldioxid till vatten. Vikten av kolsyraanhydras för frisättningen av koldioxid i lungorna framgår av följande data. För att uttorkningsreaktionen av H2CO3 löst i vatten ska inträffa, med bildning av mängden koldioxid som lämnar blodet medan det är i lungornas kapillärer, tar det 300 sekunder. Blod passerar genom lungornas kapillärer inom 1-2 sekunder, men under denna tid hinner uttorkning av kolsyra inuti de röda blodkropparna och diffusion av den resulterande CO2 först in i blodplasman och sedan in i alveolluften.

Eftersom koncentrationen av HCO3-joner i erytrocyter minskar i lungkapillärerna, börjar dessa joner från plasman att diffundera in i erytrocyterna och klorjoner diffunderar från erytrocyterna in i plasman. På grund av att spänningen av koldioxid i blodet i lungkapillärerna minskar, spjälkas karbaminbindningen och karbohemoglobin frisätter koldioxid.

Dissociationskurvor för kolsyraföreningar i blodet. Som vi redan har sagt frigörs över 85 % av den koldioxid som kan utvinnas från blodet genom att försura det som ett resultat av nedbrytningen av bikarbonater (kalium i röda blodkroppar och natrium i plasma).

Bindningen av koldioxid och dess utsläpp i blodet beror på dess partiella spänning. Det är möjligt att konstruera dissociationskurvor för koldioxidföreningar i blodet, liknande dissociationskurvorna för oxyhemoglobin. För att göra detta ritas volymprocenten av koldioxid bunden i blodet längs ordinataaxeln, och koldioxidens partiella spänningar plottas längs abskissaxeln. Den nedre kurvan i fig. 58 visar bindningen av koldioxid genom arteriellt blod, vars hemoglobin är nästan helt mättat med syre. Den övre kurvan visar bindningen av sur gas genom venöst blod.

Skillnaden i höjden på dessa kurvor beror på att arteriellt blod, rikt på oxyhemoglobin, har en lägre förmåga att binda koldioxid jämfört med venöst blod. Oxyhemoglobin är en starkare syra än kolsyra och tar bort baser från bikarbonater och bidrar därmed till frisättningen av kolsyra. I vävnader ger oxyhemoglobin, som förvandlas till hemoglobin, upp baserna som är associerade med det, vilket ökar bindningen av sur gas i blodet.

Punkt A på den nedre kurvan i fig. 58 motsvarar en syraspänning på 40 mm Hg. Art., det vill säga den spänning som faktiskt finns i artärblodet. Vid denna spänning är 52 vol.% CO2 bundet. Punkt V på den övre kurvan motsvarar en sur gasspänning på 46 mmHg. Art., dvs faktiskt finns i det venösa blodet. Som framgår av kurvan binder venöst blod vid denna spänning 58 vol.% koldioxid. AV-linjen som förbinder de övre och nedre kurvorna motsvarar de förändringar i förmågan att binda koldioxid som uppstår när arteriellt blod omvandlas till venöst eller, omvänt, venöst blod till arteriellt.

Venöst blod, på grund av att hemoglobinet det innehåller omvandlas till oxyhemoglobin, frisätter cirka 6 vol.% CO2 i lungornas kapillärer. Om hemoglobin i lungorna inte omvandlades till oxyhemoglobin, då, som kan ses av kurvan, venöst blod med ett partialtryck av koldioxid i alveolerna lika med 40 mm Hg. Art.. skulle binda 54 vol.% CO2, skulle därför ge upp inte 6, utan endast 4 vol.%. På samma sätt, om det arteriella blodet i kapillärerna i den systemiska cirkeln inte gav upp sitt syre, d.v.s. om dess hemoglobin förblev mättat med syre, då detta artärblod, vid partialtrycket av koldioxid som finns i kapillärerna i kroppsvävnaderna , skulle inte kunna binda 58 vol.% CO2, utan endast 55 vol.%.

Kolsyraanhydras(synonym: karbonatdehydratas, karbonathydrolyas) är ett enzym som katalyserar den reversibla reaktionen av koldioxidhydrering: CO 2 + H 2 O Û H 2 CO 3 Û H + + HCO 3. Finns i röda blodkroppar, celler i magslemhinnan, binjurebarken, njurarna och i små mängder i det centrala nervsystemet, bukspottkörteln och andra organ. Karbonsyraanhydras roll i kroppen är förknippad med underhåll syra-bas balans, transport av CO 2, bildning av saltsyra i magslemhinnan. Aktiviteten av kolsyraanhydras i blodet är normalt ganska konstant, men under vissa patologiska tillstånd förändras den dramatiskt. En ökning av kolsyraanhydrasaktivitet i blodet observeras vid anemi av olika ursprung, cirkulationsstörningar av II-III-graden, vissa lungsjukdomar (bronkiektasi, pneumoskleros) såväl som under graviditet. En minskning av aktiviteten av detta enzym i blodet inträffar med acidos av njurursprung, hypertyreos. Vid intravaskulär hemolys uppträder kolsyraanhydrasaktivitet i urinen, medan den normalt saknas. Det är tillrådligt att övervaka aktiviteten av kolsyraanhydras i blodet under kirurgiska ingrepp på hjärtat och lungorna, eftersom det kan fungera som en indikator på kroppens anpassningsförmåga, såväl som under terapi med kolsyraanhydrashämmare - hypotiazid, diakarb.

För att bestämma aktiviteten av kolsyraanhydras används radiologiska, immunoelektroforetiska, kolorimetriska och titrimetriska metoder. Bestämningen görs i helblod taget med heparin eller i hemolyserade röda blodkroppar. För kliniska ändamål, de mest acceptabla kolorimetriska metoderna för att bestämma kolsyraanhydrasaktivitet (till exempel modifieringar av Brinkman-metoden), baserade på bestämning av den tid som krävs för att skifta pH i inkubationsblandningen från 9,0 till 6,3 som ett resultat av CO 2 -hydratisering . Vatten mättat med koldioxid blandas med en indikator-buffertlösning och en viss mängd blodserum (0,02 ml) eller en suspension av hemolyserade erytrocyter. Fenolrött används som en indikator. När kolsyramolekyler dissocierar genomgår alla nya CO 2 -molekyler enzymatisk hydrering. För att erhålla jämförbara resultat måste reaktionen alltid fortgå vid samma temperatur, det är lämpligast att hålla temperaturen för smältande is vid 0°. Kontrollreaktionstiden (spontan reaktion av CO 2 hydratisering) är normalt 110-125 Med. Normalt, när den bestäms med denna metod, är aktiviteten för kolsyraanhydras i genomsnitt 2-2,5 konventionella enheter, och i termer av 1 miljon röda blodkroppar är den 0,458 ± 0,006 konventionella enheter (en enhet av kolsyraanhydrasaktivitet anses vara en 2-faldig ökning av hastigheten för den katalyserade reaktionen).

Bibliografi: Klinisk utvärdering av laboratorietester, red. VÄL. Titsa, per. från engelska, sid. 196, M., 1986.

Kolsyraanhydras(synonym: karbonatdehydratas, karbonathydrolyas) är ett enzym som katalyserar den reversibla reaktionen av koldioxidhydrering: CO 2 + H 2 O Û H 2 CO 3 Û H + + HCO 3. Finns i röda blodkroppar, celler i magslemhinnan, binjurebarken, njurarna och i små mängder i det centrala nervsystemet, bukspottkörteln och andra organ. K.s roll i kroppen är förknippad med att underhålla syra-bas balans, transport av CO 2, bildning av saltsyra i magslemhinnan. K:s aktivitet i blodet är normalt ganska konstant, men vid vissa patologiska tillstånd förändras den kraftigt. En ökning av K.s aktivitet i blodet observeras i fall av olika ursprung, cirkulationsstörningar av II-III-graden, vissa lungsjukdomar (bronkiektasi, pneumoskleros), samt under graviditeten. En minskning av aktiviteten av detta enzym i blodet inträffar med acidos av njurursprung, hypertyreos. Vid intravaskulär hemolys uppträder K.s aktivitet i urinen, medan den normalt saknas.

Det är tillrådligt att övervaka K.s aktivitet i blodet under kirurgiska ingrepp på hjärta och lungor, eftersom det kan fungera som en indikator på kroppens anpassningsförmåga, såväl som under terapi med kolsyraanhydrashämmare - hypotiazid, diakarb.

modifieringar av Brinkman-metoden), baserat på fastställande av den tid som krävs för att skifta inkubationsblandningens pH från 9,0 till 6,3 som ett resultat av CO2-hydratisering. Vatten mättat med koldioxid blandas med en indikator-buffertlösning och en viss mängd blodserum (0,02 ml) eller en suspension av hemolyserade erytrocyter. Fenolrött används som en indikator. När kolsyramolekyler dissocierar genomgår alla nya CO 2 -molekyler enzymatisk hydrering. För att erhålla jämförbara resultat måste reaktionen alltid fortgå vid samma temperatur, det är lämpligast att hålla temperaturen för smältande is vid 0°. Kontrollreaktionstiden (spontan reaktion av CO 2 hydratisering) är normalt 110-125 Med. Normalt, när den bestäms med denna metod, är K:s aktivitet i genomsnitt lika med 2-2,5 konventionella enheter, och i termer av 1 miljon röda blodkroppar, 0,458 ± 0,006 konventionella enheter (en enhet av K:s aktivitet tas att vara en 2-faldig ökning av hastigheten för den katalyserade reaktionen).

Bibliografi: Klinisk utvärdering av laboratorietester, red. VÄL. Titsa, per. från engelska, sid. 196, M., 1986.

jag Kolsyraanhydras (synonym: karbonatdehydratas, karbonathydrolyas)

ett enzym som katalyserar den reversibla hydreringsreaktionen av koldioxid: CO 2 + H 2 O ⇔ H 2 CO 3 ⇔ H + + HCO 3. Finns i röda blodkroppar, celler i magslemhinnan, binjurebarken, njurarna och i små mängder i det centrala nervsystemet, bukspottkörteln och andra organ. Syrans roll i kroppen är förknippad med att upprätthålla syra-basbalansen (syra-basbalansen) , transport av CO 2, bildning av saltsyra i magslemhinnan. K:s aktivitet i blodet är normalt ganska konstant, men vid vissa patologiska tillstånd förändras den kraftigt. En ökning av K.s aktivitet i blodet observeras vid anemi av olika ursprung, cirkulationsstörningar av II-III-graden, vissa lungsjukdomar (bronkiektasi, pneumoskleros) samt under graviditeten. En minskning av aktiviteten av detta enzym i blodet inträffar med acidos av njurursprung, hypertyreos. Vid intravaskulär hemolys uppträder K.s aktivitet i urinen, medan den normalt saknas. Det är tillrådligt att övervaka K.s aktivitet i blodet under kirurgiska ingrepp på hjärta och lungor, eftersom det kan fungera som en indikator på kroppens anpassningsförmåga, såväl som under terapi med kolsyraanhydrashämmare - hypotiazid, diakarb.

För att bestämma K.s aktivitet används radiologiska, immunoelektroforetiska, kolorimetriska och titrimetriska metoder. Bestämningen görs i helblod taget med heparin eller i hemolyserade röda blodkroppar. För kliniska ändamål, de mest acceptabla kolorimetriska metoderna för att bestämma K-aktivitet (till exempel modifieringar av Brinkman-metoden), baserade på fastställande av den tid som krävs för att skifta pH i inkubationsblandningen från 9,0 till 6,3 som ett resultat av CO2-hydratisering. Vatten mättat med koldioxid blandas med en indikator-buffertlösning och en viss mängd blodserum (0,02 ml) eller en suspension av hemolyserade erytrocyter. Fenolrött används som en indikator. När kolsyramolekyler dissocierar genomgår alla nya CO 2 -molekyler enzymatisk hydrering. För att erhålla jämförbara resultat måste reaktionen alltid fortgå vid samma temperatur, det är lämpligast att hålla temperaturen för smältande is vid 0°. Kontrollreaktionstiden (spontan reaktion av CO 2 hydratisering) är normalt 110-125 Med. Normalt, när den bestäms med denna metod, är K:s aktivitet i genomsnitt lika med 2-2,5 konventionella enheter, och i termer av 1 miljon röda blodkroppar, 0,458 ± 0,006 konventionella enheter (en enhet av K:s aktivitet tas att vara en 2-faldig ökning av hastigheten för den katalyserade reaktionen).

Bibliografi: Klinisk utvärdering av laboratorietester, red. VÄL. Titsa, per. från engelska, sid. 196, M., 1986.

II Kolsyraanhydras

- ett enzym som katalyserar den reversibla reaktionen av bildning av kolsyra från koldioxid och vatten. K.-hämmare används inom medicin för behandling av vissa kardiovaskulära och andra sjukdomar...
Naturvetenskap. encyklopedisk ordbok
- I Kolsyraanhydras är ett enzym som katalyserar den reversibla reaktionen av koldioxidhydrering: CO2 + H2O ⇔ H2CO3 ⇔ H+ + HCO3...
Medicinsk uppslagsverk
- ett zinkhaltigt enzym av kol-syre-lyasgruppen, som katalyserar den reversibla reaktionen av klyvningen av kolsyra till koldioxid och vatten...
Stor medicinsk ordbok
- kolsyraanhydras, karbonathydrolyas, ett enzym av lyasklassen, som katalyserar den reversibla bildningen av kolsyra från koldioxid och vatten: CO2 + H2O ↔ H2CO3. K. är ett metalloprotein som innehåller Zn...

Syftet med arbetet är att fastställa de faktorer som påverkar aktiviteten av zinkhaltigt kolsyraanhydras i reproduktionssystemet hos råttor av hankön under förhållanden av exponering för lågintensiv mikrovågsstrålning. Kolsyraanhydras spelar en viktig roll i metabolismen av sädesplasma och mognad av spermier. Kolsyraanhydrasaktivitet i vattensaltextrakt av bitestikel och testiklar från råttor i kontrollgruppen varierar enligt våra data från 84,0 ± 74,5 U/ml, vilket i termer av vävnadsvikt är 336,0 ± 298,0 U/mg. Sambandet mellan koncentrationen av zink- och polyaminjoner och aktiviteten av kolsyraanhydras studerades. Aktiviteten av kolsyraanhydras i reproduktionssystemet hos råttor av hankön har ett komplext regleringsschema, som uppenbarligen inte är begränsat till de faktorer vi har beskrivit. Baserat på de erhållna resultaten kan man dra slutsatsen att rollen för olika regulatorer av aktiviteten hos detta enzym varierar beroende på graden av kolsyraanhydrasaktivitet. Det är troligt att höga sperminkoncentrationer begränsar transkriptionen av kolsyraanhydrasgenen, givet data om funktionerna hos denna polyamin. Spermidin fungerar troligen som en begränsande faktor vid de posttribosomala stadierna av reglering av kolsyraanhydrasaktivitet, och putrescin och koncentrationen av zinkjoner är relaterade aktiveringsfaktorer.

reproduktionssystem hos råttor av hankön

zinkjonkoncentration

polyaminer

kolsyraanhydras

1. Boyko O.V. Metodologiska aspekter av användningen av saltsyraspermin och spermidin för identifiering av uropatogen mikroflora / O.V. Boyko, A.A. Terentyev, A.A. Nikolaev // Problem med reproduktion. – 2010. – Nr 3. – S. 77-79.

2. Ilyina O.S. Förändringar i zinkhalten i humant blod vid typ I-diabetes mellitus och egenskaper hos den hypoglykemiska effekten av det zinkhaltiga insulin-kondroitinsulfatkomplexet: abstrakt. dis. ...cand. biol. Sci. – Ufa, 2012. – 24 sid.

3. Lutsky D.L. Proteinspektrum av ejakulat av olika fertilitet / D.L. Lutsky, A.A. Nikolaev, L.V. Lozhkina // Urologi. – 1998. – Nr 2. – S. 48-52.

4. Nikolaev A.A. Aktivitet av spermoplasmatiska enzymer i ejakulat av olika fertilitet / A.A. Nikolaev, D.L. Lutsky, V.A. Bochanovsky, L.V. Lozhkina // Urologi. – 1997. – Nr 5. – S. 35.

5. Ploskonos M.V. Bestämning av polyaminer i olika biologiska föremål / M.V. Ploskonos, A.A. Nikolaev, A.A. Nikolaev // Astrakhan State. honung. acad. – Astrakhan, 2007. – 118 sid.

6. Polunin A.I. Användningen av zinkpreparat vid behandling av manlig subfertilitet / A.I. Polunin, V.M. Miroshnikov, A.A. Nikolaev, V.V. Dumchenko, D.L. Lutsky // Mikroelement i medicin. – 2001. – T. 2. – Nr 4. – S. 44-46.

7. Haggis G.C., Gortos K. Kolsyraanhydrasaktivitet i reproduktionsorganens vävnader hos råttor och dess förhållande till spermaproduktion // J. Fert. Reprod. – 2014. - V. 103. - S. 125-130.

Det är känt att aktiviteten hos zink-innehållande kolsyraanhydras är hög i reproduktionssystemet hos fåglar, däggdjur och människor. Aktiviteten hos detta enzym påverkar mognaden av spermier, deras antal och spermievolym. Men det finns ingen information om förändringar i kolsyraanhydrasaktivitet under påverkan av andra konstanta komponenter i reproduktionssystemet, såsom zinkjoner och polyaminer (putrescin, spermin och spermidin), som aktivt påverkar spermatogenesen. Endast en allmän beskrivning av konsekvenserna av förändringar i kolsyraanhydrasaktivitet på det morfofunktionella tillståndet hos organen i reproduktionssystemet hos hanråttor, antalet spermier och deras motilitet ges.

Syftet med vårt arbete var en studie av aktiviteten av zink-innehållande kolsyraanhydras och dess samband med nivån av polyaminer och zinkjoner i vävnaden i reproduktionssystemet hos könsmogna hanråttor.

Material och metoder. Den experimentella delen av studien inkluderade 418 vita Wistar-hanråttor. Råttorna var 6-7 månader gamla (mogna individer). Råttornas kroppsvikt var 180-240 g, hållen under standard vivariumbetingelser. För att undvika påverkan av säsongsmässiga skillnader i svar på experimentell påverkan genomfördes alla studier under höst-vinterperioden på året. Insamlingen av testiklar och bitestiklarna från råttor utfördes under eterbedövning (experimentella studier utfördes i strikt överensstämmelse med Helsingforsdeklarationen om human behandling av djur).

Syftet med vår studie var vattensaltextrakt av bitestikel och testiklar från könsmogna vita hanråttor. Extrakt framställdes i tris-saltsyrabuffert pH = 7,6 i vikt/volymförhållandet 1/5, efter fyra gånger frysning, upptining och centrifugering vid 8000 g under 50 minuter frystes proverna och förvarades vid -24 °C tills studien.

Bestämning av zink. Till 2 ml av det undersökta extraktet sattes 0,1 ml 10% NaOH och 0,2 ml av en 1% lösning av ditizon i koltetraklorid. I den negativa kontrollen tillsattes 2 ml destillerat vatten, i den positiva kontrollen - 2 ml av en 20 μmol zinksulfatlösning (molär koncentration av en standard zinksulfatlösning). Prover fotometerades vid 535 nm. Koncentrationen av zinkkatjoner i provet beräknades med hjälp av formeln: CZn=20 µmol x Prov OD535/Standard OD535, där Prov OD535 är provets optiska densitet, mätt vid 535 nm; OD535 Standard - optisk densitet för en standardlösning på 20 mikromolar av zinksulfat, mätt vid 535 nm.

Bestämning av kolsyraanhydras. Metoden är baserad på reaktionen av bikarbonatdehydrering med avlägsnande av koldioxid som bildas som ett resultat av dehydrering med intensiv bubbling av reaktionsmediet med luft befriad från kolmonoxid och samtidig registrering av förändringshastigheten i pH. Reaktionen initieras genom att snabbt införa en lösning av substratet - natriumbikarbonat (10 mM) i reaktionsblandningen som innehåller testprovet. I detta fall ökar pH med 0,01-0,05 enheter. Prover (10,0-50,0 mg) av epididymis och testiklar från sexuellt mogna vita hanråttor homogeniserades och centrifugerades vid 4500 g under 30 minuter. vid 4°C, och supernatanten späds med dubbeldestillerat vatten vid 4°C till en volym som gör det möjligt att mäta reaktionstiden. Kolsyraanhydrasaktiviteten bestäms av förändringen i det initiala pH-värdet från 8,2 till 8,7 i CO2-dehydreringsreaktionen. Ackumuleringshastigheten för hydroxyljoner mäts elektrometriskt med hjälp av en känslig programmerbar pH-mätare (InoLab pH 7310) ansluten till en PC. pH-förskjutningen från 8,2 till 8,7, som en funktion av tiden i den linjära sektionen, tar hänsyn till enzymaktiviteten. Medeltiden (T) för 4 mätningar beräknades. Tiden för pH-ändring under spontan hydratisering av CO2 i ett medium utan prov togs som kontroll. Kolsyraanhydrasaktivitet uttrycktes i enzymenheter (U) per mg våt vävnad enligt ekvationen: ED = 2 (TO - T)/ (T0 × mg vävnad i reaktionsblandningen), där T0 = medeltid för 4 mätningar av en ren lösning av 4 ml kylt, mättad koldioxid, dubbeldestillerat vatten.

Bestämning av polyaminer. Prover (100–200 mg) av epididymis och testiklar från mogna albinoråttor av hankön homogeniserades, suspenderades i 1 ml 0,2 normal perklorsyra för att extrahera fria polyaminer och centrifugerades. Till 100 μl av supernatanten sattes 110 μl 1,5 M natriumkarbonat och 200 μl dansylklorid (7,5 mg/ml lösning i aceton; Sigma, München, Tyskland). Dessutom tillsattes 10 μL 0,5 mM diaminohexan som intern standard. Efter 1 h inkubation vid 60°C i mörker tillsattes 50 μL prolinlösning (100 mg/ml) för att binda fri dansylklorid. Sedan extraherades dansylderivat av polyaminer (nedan kallade DNSC-polyaminer) med toluen, sublimerades i en vakuumindunstare och löstes i metanol. Kromatografi utfördes på en omvänd fas LC 18-kolonn (Supelco), i ett högpresterande vätskekromatografisystem (Dionex) bestående av en gradientblandare (modell P 580), en automatisk injektor (ASI 100) och en fluorescensdetektor (RF 2000) . Polyaminer eluerades i en linjär gradient från 70 % till 100 % (v/v) metanol i vatten med en flödeshastighet av 1 mL/min och detekterades vid en excitationsvåglängd på 365 nm och en emissionsvåglängd på 510 nm. Data analyserades med hjälp av programvaran Dionex Chromeleon och kvantifiering utfördes med kalibreringskurvor erhållna från en blandning av rena substanser (Figur A).

Högpresterande kromatografi av DNSC-polyaminer:

A - kromatogram av en standardblandning av DNSC-polyaminer; B - kromatogram av DNSC-polyaminer från ett av vävnadsproverna från bitestiklarna och testiklarna från hanråttor. 1 - putrescin; 2 - kadaverin; 3 - hexandiamin (intern standard); 4 - spermidin; 5 - spermin. X-axeln är tiden i minuter, y-axeln är fluorescens. Onumrerade toppar - oidentifierade föroreningar

Forskningsresultat och diskussion. Som bekant spelar kolsyraanhydras en viktig roll i metabolismen av sädesplasma och mognad av spermier. Kolsyraanhydrasaktivitet i vattensaltextrakt av bitestikel och testiklar från råttor i kontrollgruppen varierar enligt våra data från 84,0 ± 74,5 U/ml, vilket i termer av vävnadsvikt är 336,0 ± 298,0 U/mg. En sådan hög aktivitet hos enzymet kan förklaras av dess viktiga fysiologiska roll. Som jämförelse är aktivitetsnivån för detta enzym i andra vävnader från samma djur mycket lägre (tabell 1), förutom för helblod, i vilket hög aktivitet av erytrocytkolsyraanhydras är känd. Vad som dock är anmärkningsvärt är den mycket stora spridningen i värdena för kolsyraanhydrasaktivitet i bitestiklarna och testiklarna, vars variationskoefficient är mer än 150% (tabell 1).

bord 1

Kolsyraanhydrasaktivitet i vävnader hos könsmogna män

Manråttvävnad	Enzymaktivitet, enheter	Antal observationer	Variationskoefficienten, %


Hjärnvävnad
Muskel
Slemhinnan i mag-tarmkanalen
bitestiklarna och testiklarna
Helblod

Detta indikerar inflytandet av okända faktorer på enzymaktiviteten. Det finns två omständigheter som förklarar denna funktion. För det första är det känt att biologiskt aktiva aminer, inklusive polyaminerna spermidin och spermin, har förmåga att aktivera kolsyraanhydras. Det är det manliga reproduktionssystemet som är den rikaste källan till spermin och spermidin. Därför genomförde vi en parallell bestämning av koncentrationen av polyaminer i vattensaltextrakt av epididymis och testiklar från hanråttor. Polyaminerna spermidin, spermin och putrescin analyserades med HPLC såsom beskrivs i Metoder. Det visades att spermin, spermidin och putrescin detekterades i vävnaden i bitestiklarna och testiklarna hos råttor av hankön (Fig. B).

Hos friska sexuellt mogna råttor av hankön var sperminnivån 5,962±4,0,91 µg/g vävnad, spermidin 3,037±3,32 µg/g vävnad, putrescin 2,678±1,82 µg/g vävnad och spermin/198-förhållandet spermin/198-. Dessutom, enligt våra data, är både nivån av spermidin och nivån av spermin (i mindre utsträckning) föremål för betydande fluktuationer. Korrelationsanalys visade ett signifikant positivt samband (r=+0,3) mellan nivåerna av spermin och spermidin, respektive spermidin och putrescin (r=+0,42). Uppenbarligen är denna omständighet en av faktorerna som påverkar den höga spridningen av resultaten av bestämning av kolsyraanhydrasaktivitet.

En annan regulator av kolsyraanhydrasaktivitet kan vara nivån av zink i reproduktionsvävnaden hos könsmogna hanråttor. Enligt våra data varierar nivån av zinkjon kraftigt, från 3,2 till 36,7 μg/g vävnad av den totala beredningen av testiklarna och bitestiklarna hos sexuellt mogna hanråttor.

Korrelationsanalys av zinknivåer med nivåer av spermin-, spermidin- och kolsyraanhydrasaktivitet visade olika nivåer av positiv korrelation mellan koncentrationen av zinkjoner och dessa metaboliter. En obetydlig nivå av association hittades med spermin (+0,14). Med tanke på antalet använda observationer är denna korrelation inte signifikant (p≥0,1). En signifikant positiv korrelation hittades mellan nivån av zinkjoner och koncentrationen av putrescin (+0,42) och koncentrationen av spermidin (+0,39). En förväntat hög positiv korrelation (+0,63) hittades också mellan koncentrationen av zinkjoner och kolsyraanhydrasaktivitet.

I nästa steg försökte vi kombinera koncentrationen av zink och nivån av polyaminer som faktorer som reglerar kolsyraanhydrasaktivitet. Vid analys av variationsserierna för den gemensamma bestämningen av koncentrationen av zinkjoner, polyaminer och kolsyraanhydrasaktivitet avslöjades vissa regelbundenheter. Det visades att av 69 studier utförda på nivån av kolsyraanhydrasaktivitet kan tre grupper urskiljas:

Grupp 1 - hög aktivitet från 435 till 372 enheter (antal observationer 37),

Grupp 2 - låg aktivitet från 291 till 216 enheter (antal observationer 17),

Grupp 3 - mycket låg aktivitet från 177 till 143 enheter (antal observationer 15).

Vid rangordning av nivåerna av polyaminer och koncentrationen av zinkjoner med dessa grupper avslöjades en intressant egenskap som inte framkom vid analys av variationsserien. De maximala sperminkoncentrationerna (i genomsnitt 9,881±0,647 μg/g vävnad) är associerade med den tredje gruppen av observationer med mycket låg kolsyraanhydrasaktivitet, och den lägsta (i genomsnitt 2,615±1,130 μg/g vävnad) med den andra gruppen med låg enzymaktivitet.

Det största antalet observationer är associerat med den första gruppen med en hög nivå av kolsyraanhydrasaktivitet; i denna grupp är sperminkoncentrationerna nära medelvärden (i genomsnitt 4,675 ± 0,725 μg/g vävnad).

Koncentrationen av zinkjoner uppvisar ett komplext samband med aktiviteten av kolsyraanhydras. I den första gruppen av kolsyraanhydrasaktivitet (tabell 2) är koncentrationen av zinkjoner också högre än värdena i andra grupper (i genomsnitt 14,11±7,25 μg/g vävnad). Vidare minskar koncentrationen av zinkjoner i enlighet med minskningen av kolsyraanhydrasaktivitet, men denna minskning är inte proportionell. Om aktiviteten av kolsyraanhydras i den andra gruppen minskar jämfört med den första med 49,6% och i den tredje med 60,35%, minskar koncentrationen av zinkjoner i den andra gruppen med 23% och i den tredje med 39%.

Tabell 2

Sambandet mellan koncentrationen av polyaminer och zinkjoner och aktiviteten av kolsyraanhydras

Aktivitetsgrupper kolsyraanhydras, enheter	Genomsnittlig koncentration spermin, µg/g vävnad	Genomsnittlig koncentration spermidin, µg/g vävnad	Genomsnittlig koncentration putrescin, µg/g vävnad	Genomsnittlig koncentration zinkjoner, µg/g vävnad

Detta indikerar ytterligare faktorer som påverkar aktiviteten av detta enzym. Dynamiken för putrescinkoncentration ser något annorlunda ut (tabell 2). Nivån av denna polyamin sjunker i snabbare takt, och i den tredje jämförelsegruppen är nivån av putrescin lägre i genomsnitt med nästan 74%. Dynamiken i spermidinnivån skiljer sig genom att de "hoppande" koncentrationsvärdena för denna polyamin är associerade främst med den andra gruppen av aktivitetsnivåer av kolsyraanhydras. Med hög aktivitet av detta enzym (grupp 1) är spermidinkoncentrationen något högre än genomsnittet för alla observationer, och i den tredje gruppen är den nästan 4 gånger lägre än koncentrationen i den andra gruppen.

Sålunda har aktiviteten av kolsyraanhydras i reproduktionssystemet hos råttor av hankön ett komplext regleringsschema, som uppenbarligen inte är begränsat till de faktorer vi har beskrivit. Baserat på de erhållna resultaten kan man dra slutsatsen att rollen för olika regulatorer av aktiviteten hos detta enzym varierar beroende på graden av kolsyraanhydrasaktivitet. Det är troligt att höga sperminkoncentrationer begränsar transkriptionen av kolsyraanhydrasgenen, givet data om funktionerna hos denna polyamin. Spermidin fungerar troligen som en begränsande faktor vid de posttribosomala stadierna av reglering av kolsyraanhydrasaktivitet, och putrescin och koncentrationen av zinkjoner är relaterade aktiveringsfaktorer.

Under dessa förhållanden blir det inte bara viktigt att bedöma påverkan av externa faktorer (inklusive de som förändrar reproduktionsfunktionen) på aktiviteten av kolsyraanhydras, som en av de viktiga länkarna i metabolismen av reproduktionssystemet hos manliga däggdjur, utan också en ganska komplex process som kräver ett stort antal kontroller och multilateral bedömning.

Bibliografisk länk

Kuznetsova M.G., Ushakova M.V., Gudinskaya N.I., Nikolaev A.A. REGLERING AV AKTIVITETEN HOS ZINKHÅLLANDE KOLHYDRAS I REPRODUKTIONSSYSTEMET HOS HANRÅTTOR // Moderna problem inom vetenskap och utbildning. – 2017. – Nr 2.;
URL: http://site/ru/article/view?id=26215 (åtkomstdatum: 2019/07/19).