Ролята на карбоанхидразата. Съвременни проблеми на науката и образованието

55-58 об.% въглероден диоксид може да бъде извлечен от венозна кръв. По-голямата част от CO2, извлечен от кръвта, идва от соли на въглена киселина, присъстващи в плазмата и еритроцитите, и само около 2,5 об.% въглероден диоксид се разтваря и около 4-5 об.% се комбинират с хемоглобина под формата на карбохемоглобин.

Въглеродната киселина се образува от въглероден диоксид в червените кръвни клетки, които съдържат ензима карбоанхидраза, който е мощен катализатор, който ускорява реакцията на хидратация на CO2.

Свързване на въглероден диоксид в кръвта в капилярите на системния кръг.Въглеродният диоксид, образуван в тъканите, дифундира в кръвта на кръвоносните капиляри, тъй като напрежението на CO2 в тъканите значително надвишава напрежението му в артериалната кръв. CO2, разтворен в плазмата, дифундира в червените кръвни клетки, където под влияние карбоанхидразанезабавно се превръща във въглена киселина,

Според изчисленията активността на карбоанхидразата в еритроцитите е такава, че реакцията на хидратация на въглероден диоксид се ускорява 1500-2000 пъти. Тъй като целият въглероден диоксид в еритроцита се превръща във въглеродна киселина, напрежението на CO2 вътре в еритроцита е близо до нула, така че все повече и повече нови количества CO2 влизат в еритроцита. Поради образуването на въглена киселина от CO3 в еритроцита, концентрацията на HCO3" йони се увеличава и те започват да дифундират в плазмата. Това е възможно, тъй като повърхностната мембрана на еритроцита е пропусклива за аниони. За катионите, еритроцитите мембраната е практически непропусклива. Вместо HCO3" йони, еритроцитният йон влиза в хлор Преминаването на хлорните йони от плазмата в еритроцита освобождава натриеви йони в плазмата, които свързват постъпващите в еритроцита HCO3 йони, образувайки NaHCO3. Химическият анализ на венозна кръвна плазма показва значително увеличение на бикарбонатите в нея.

Натрупването на аниони вътре в еритроцита води до повишаване на осмотичното налягане вътре в еритроцита и това предизвиква преминаването на вода от плазмата през повърхностната мембрана на еритроцита. В резултат на това се увеличава обемът на червените кръвни клетки в системните капиляри. Проучване, използващо хематокрит, разкрива, че червените кръвни клетки заемат 40% от обема на артериалната кръв и 40,4% от обема на венозната кръв. От това следва, че обемът на еритроцитите на венозната кръв е по-голям от този на артериалните еритроцити, което се обяснява с проникването на вода в тях.

Едновременно с навлизането на CO2 в еритроцита и образуването на въглена киселина в него, кислородът се освобождава от оксихемоглобина и се превръща в редуциран хемоглобин. Последният е много по-малко дисоциираща киселина от оксихемоглобина и въглеродната киселина. Следователно, когато оксихемоглобинът се превръща в хемоглобин, H2CO3 измества калиевите йони от хемоглобина и, комбинирайки се с тях, образува калиевата сол на бикарбоната.

Освободеният H˙ йон на въглената киселина се свързва с хемоглобина. Тъй като намаленият хемоглобин е леко дисоциирана киселина, няма подкисляване на кръвта и разликата в pH между венозна и артериална кръв е изключително малка. Реакцията, протичаща в червените кръвни клетки на тъканните капиляри, може да бъде представена по следния начин:

KHbO2 + H2CO3= HHb + O2 + KHSO3

От горното следва, че оксихемоглобинът, превръщайки се в хемоглобин и предавайки свързаните с него основи на въглероден диоксид, насърчава образуването на бикарбонат и транспортирането на въглероден диоксид в тази форма. Освен това gcmoglobin образува химично съединение с CO2 - carbohemoglobin. Наличието на хемоглобин и въглероден диоксид в кръвта се определя чрез следния експеримент. Ако към цяла кръв се добави калиев цианид, който напълно инактивира карбоанхидразата, се оказва, че червените кръвни клетки на такава кръв свързват повече CO2, отколкото плазмата. От това се заключава, че свързването на СО2 от еритроцитите след инактивиране на карбоанхидразата се обяснява с наличието на хемоглобиново съединение с СО2 в еритроцитите. По-късно беше открито, че CO2 се свързва с аминогрупата на хемоглобина, образувайки така наречената карбаминова връзка.

Реакцията на образуване на карбохемоглобин може да върви в една или друга посока в зависимост от напрежението на въглеродния диоксид в кръвта. Въпреки че малка част от общото количество въглероден диоксид, който може да бъде извлечен от кръвта, се комбинира с хемоглобина (8-10%), ролята на това съединение в транспорта на въглероден диоксид в кръвта е доста голяма. Приблизително 25-30% от въглеродния диоксид, абсорбиран от кръвта в системните капиляри, се свързва с хемоглобина, за да образува карбохемоглобин.

Освобождаване на CO2 от кръвта в белодробните капиляри. Поради по-ниското парциално налягане на CO2 в алвеоларния въздух в сравнение с неговото напрежение във венозната кръв, въглеродният диоксид преминава чрез дифузия от кръвта на белодробните капиляри в алвеоларния въздух. Напрежението CO2 в кръвта спада.

В същото време, поради по-високото парциално налягане на кислорода в алвеоларния въздух в сравнение с неговото напрежение във венозната кръв, кислородът тече от алвеоларния въздух в кръвта на капилярите на белите дробове. Напрежението на O2 в кръвта се увеличава и хемоглобинът се превръща в оксихемоглобин. Тъй като последният е киселина, чиято дисоциация е много по-висока от тази на въглеродния хемоглобин, той измества въглеродната киселина от своята калиева киселина. Реакцията протича по следния начин:

ННb + O2 + KНSO3= KНbO2+H2CO3

Въглеродната киселина, освободена от връзката си с основи, се разгражда от въглеродна анхидраза до въглероден диоксид във вода. Значението на карбоанхидразата за освобождаването на въглероден диоксид в белите дробове може да се види от следните данни. За да настъпи реакцията на дехидратация на H2CO3, разтворен във вода, с образуването на количеството въглероден диоксид, което напуска кръвта, докато е в капилярите на белите дробове, са необходими 300 секунди. Кръвта преминава през капилярите на белите дробове за 1-2 секунди, но през това време се извършва дехидратация на въглеродната киселина вътре в червените кръвни клетки и дифузия на получения CO2 първо в кръвната плазма и след това в алвеоларния въздух.

Тъй като концентрацията на HCO3 йони в еритроцитите намалява в белодробните капиляри, тези йони от плазмата започват да дифундират в еритроцитите, а хлорните йони дифундират от еритроцитите в плазмата. Поради факта, че напрежението на въглеродния диоксид в кръвта на белодробните капиляри намалява, карбаминовата връзка се разцепва и карбохемоглобинът освобождава въглероден диоксид.

Криви на дисоциация на съединенията на въглеродната киселина в кръвта. Както вече казахме, над 85% от въглеродния диоксид, който може да бъде извлечен от кръвта чрез подкисляването й, се освобождава в резултат на разграждането на бикарбонатите (калий в червените кръвни клетки и натрий в плазмата).

Свързването на въглеродния диоксид и освобождаването му в кръвта зависи от парциалното му напрежение. Възможно е да се конструират криви на дисоциация за съединенията на въглеродния диоксид в кръвта, подобни на кривите на дисоциация за оксихемоглобина. За да направите това, обемните проценти на въглеродния диоксид, свързан в кръвта, се нанасят по ординатната ос, а частичните напрежения на въглеродния диоксид се нанасят по абсцисната ос. Долната крива на фиг. 58 показва свързването на въглероден диоксид от артериалната кръв, чийто хемоглобин е почти напълно наситен с кислород. Горната крива показва свързването на киселинния газ от венозна кръв.

Разликата във височината на тези криви зависи от факта, че артериалната кръв, богата на оксихемоглобин, има по-ниска способност да свързва въглероден диоксид в сравнение с венозната кръв. Тъй като е по-силна киселина от въглеродната киселина, оксихемоглобинът премахва основите от бикарбонатите и по този начин допринася за освобождаването на въглеродна киселина. В тъканите оксихемоглобинът, превръщайки се в хемоглобин, се отказва от свързаните с него основи, увеличавайки свързването на киселинния газ в кръвта.

Точка А на долната крива на фиг. 58 съответства на киселинно напрежение от 40 mm Hg. ст., т.е. напрежението, което действително съществува в артериалната кръв. При това напрежение се свързват 52 об.% CO2. Точка V на горната крива съответства на напрежение на киселинния газ от 46 mmHg. чл., т.е. действително присъства във венозната кръв. Както се вижда от кривата, при това напрежение венозната кръв свързва 58 об.% въглероден диоксид. AV линията, свързваща горната и долната крива, съответства на тези промени в способността за свързване на въглероден диоксид, които възникват, когато артериалната кръв се превръща във венозна или, обратно, венозната кръв в артериална.

Венозната кръв, поради факта, че съдържащият се в нея хемоглобин се превръща в оксихемоглобин, отделя около 6 об.% CO2 в капилярите на белите дробове. Ако хемоглобинът в белите дробове не се превръща в оксихемоглобин, тогава, както се вижда от кривата, венозната кръв с парциално налягане на въглеродния диоксид в алвеолите е равно на 40 mm Hg. Чл. би свързал 54 об.% CO2, следователно би отказал не 6, а само 4 об.%. По същия начин, ако артериалната кръв в капилярите на системния кръг не се е отказала от своя кислород, тоест ако нейният хемоглобин остане наситен с кислород, тогава тази артериална кръв, при парциалното налягане на въглеродния диоксид, присъстващ в капилярите на тялото, тъкани, не биха могли да свържат 58 об.% CO2, а само 55 об.%.

Карбоанхидраза(синоним: карбонатна дехидратаза, карбонатна хидролиза) е ензим, който катализира обратимата реакция на хидратация на въглероден диоксид: CO 2 + H 2 O Û H 2 CO 3 Û H + + HCO 3. Съдържа се в червените кръвни клетки, клетките на стомашната лигавица, надбъбречната кора, бъбреците и в малки количества в централната нервна система, панкреаса и други органи. Ролята на карбоанхидразата в организма е свързана с поддържането киселинно-алкален баланс,транспорт на CO 2, образуване на солна киселина от стомашната лигавица. Активността на карбоанхидразата в кръвта обикновено е доста постоянна, но при някои патологични състояния се променя драстично. Повишена активност на карбоанхидразата в кръвта се наблюдава при анемия от различен произход, нарушения на кръвообращението от II-III степен, някои белодробни заболявания (бронхиектазии, пневмосклероза), както и по време на бременност. Намаляване на активността на този ензим в кръвта възниква при ацидоза от бъбречен произход, хипертиреоидизъм. При вътресъдова хемолиза активността на карбоанхидразата се появява в урината, докато обикновено липсва. Препоръчително е да се следи активността на карбоанхидразата в кръвта по време на хирургични интервенции на сърцето и белите дробове, т.к. може да служи като индикатор за адаптивните възможности на организма, както и при терапия с инхибитори на карбоанхидразата - хипотиазид, диакарб.

За определяне на активността на карбоанхидразата се използват радиологични, имуноелектрофоретични, колориметрични и титриметрични методи. Определянето се извършва в цяла кръв, взета с хепарин, или в хемолизирани червени кръвни клетки. За клинични цели най-приемливите колориметрични методи за определяне на активността на карбоанхидразата (например модификации на метода на Brinkman), базирани на определяне на времето, необходимо за изместване на рН на инкубационната смес от 9,0 до 6,3 в резултат на хидратация на CO 2 . Вода, наситена с въглероден диоксид, се смесва с индикаторно-буферен разтвор и определено количество кръвен серум (0,02 мл) или суспензия от хемолизирани еритроцити. Като индикатор се използва фенолово червено. Тъй като молекулите на въглеродната киселина се дисоциират, всички нови CO 2 молекули претърпяват ензимна хидратация. За получаване сравними резултатиреакцията винаги трябва да протича при една и съща температура; най-удобно е температурата на топене на лед да се поддържа при 0°. Контролното време за реакция (спонтанна реакция на CO 2 хидратация) обикновено е 110-125 с. Обикновено, когато се определя по този метод, активността на карбоанхидразата е средно 2-2,5 конвенционални единици, а по отношение на 1 милион червени кръвни клетки е 0,458 ± 0,006 конвенционални единици (единица активност на карбоанхидразата се приема за 2-кратно увеличение на скоростта на катализираната реакция).

Библиография:Клинична оценка на лабораторните изследвания, изд. ДОБРЕ. Тица, пер. от английски, стр. 196, М., 1986.

Карбоанхидраза(синоним: карбонатна дехидратаза, карбонатна хидролиза) е ензим, който катализира обратимата реакция на хидратация на въглероден диоксид: CO 2 + H 2 O Û H 2 CO 3 Û H + + HCO 3. Съдържа се в червените кръвни клетки, клетките на стомашната лигавица, надбъбречната кора, бъбреците и в малки количества в централната нервна система, панкреаса и други органи. Ролята на К. в организма е свързана с поддържането киселинно-алкален баланс, транспорт на CO 2, образуване на солна киселина от стомашната лигавица. Активността на К. в кръвта обикновено е доста постоянна, но при някои патологични състояния тя се променя рязко. Повишаване на активността на К. в кръвта се наблюдава при случаи с различен произход, нарушения на кръвообращението от II-III степен, някои белодробни заболявания (бронхиектазии, пневмосклероза), както и по време на бременност. Намаляване на активността на този ензим в кръвта възниква при ацидоза от бъбречен произход, хипертиреоидизъм. При интраваскуларна хемолиза активността на К. се проявява в урината, докато обикновено отсъства.

Препоръчително е да се следи активността на К. в кръвта по време на хирургични интервенции на сърцето и белите дробове, т.к. може да служи като индикатор за адаптивните възможности на организма, както и при терапия с инхибитори на карбоанхидразата - хипотиазид, диакарб.

модификации на метода на Brinkman), базирани на установяване на времето, необходимо за изместване на pH на инкубационната смес от 9,0 на 6,3 в резултат на хидратация на CO 2 . Вода, наситена с въглероден диоксид, се смесва с индикаторно-буферен разтвор и определено количество кръвен серум (0,02 мл) или суспензия от хемолизирани еритроцити. Като индикатор се използва фенолово червено. Тъй като молекулите на въглеродната киселина се дисоциират, всички нови CO 2 молекули претърпяват ензимна хидратация. За да се получат сравними резултати, реакцията винаги трябва да протича при една и съща температура; най-удобно е температурата на топящия се лед да се поддържа на 0°. Контролното време за реакция (спонтанна реакция на CO 2 хидратация) обикновено е 110-125 с. Обикновено, когато се определя по този метод, активността на К. е средно равна на 2-2,5 конвенционални единици, а по отношение на 1 милион червени кръвни клетки, 0,458 ± 0,006 конвенционални единици (взема се единица активност на К. да бъде 2-кратно увеличение на скоростта на катализираната реакция).

Библиография:Клинична оценка на лабораторните изследвания, изд. ДОБРЕ. Тица, пер. от английски, стр. 196, М., 1986.

аз Карбоанхидраза (синоним: карбонатна дехидратаза, карбонатна хидролиза)

ензим, който катализира реакцията на обратима хидратация на въглероден диоксид: CO 2 + H 2 O ⇔ H 2 CO 3 ⇔ H + + HCO 3. Съдържа се в червените кръвни клетки, клетките на стомашната лигавица, надбъбречната кора, бъбреците и в малки количества в централната нервна система, панкреаса и други органи. Ролята на киселината в организма е свързана с поддържането на киселинно-алкалния баланс (киселинно-базов баланс) , транспорт на CO 2, образуване на солна киселина от стомашната лигавица. Активността на К. в кръвта обикновено е доста постоянна, но при някои патологични състояния тя се променя рязко. Увеличаване на активността на K. в кръвта се наблюдава при анемия от различен произход, нарушения на кръвообращението от II-III степен, някои белодробни заболявания (бронхиектазии, пневмосклероза), както и по време на бременност. Намаляването на активността на този ензим в кръвта възниква при ацидоза от бъбречен произход, хипертиреоидизъм. При интраваскуларна хемолиза активността на К. се проявява в урината, докато обикновено отсъства. Препоръчително е да се следи активността на К. в кръвта по време на хирургични интервенции на сърцето и белите дробове, т.к. може да служи като индикатор за адаптивните възможности на организма, както и при терапия с инхибитори на карбоанхидразата - хипотиазид, диакарб.

За определяне на активността на К. се използват радиологични, имуноелектрофоретични, колориметрични и титриметрични методи. Определянето се извършва в цяла кръв, взета с хепарин, или в хемолизирани червени кръвни клетки. За клинични цели най-приемливите колориметрични методи за определяне на K активността (например модификации на метода на Brinkman), базирани на установяване на времето, необходимо за изместване на рН на инкубационната смес от 9,0 до 6,3 в резултат на хидратация на CO 2. Вода, наситена с въглероден диоксид, се смесва с индикаторно-буферен разтвор и определено количество кръвен серум (0,02 мл) или суспензия от хемолизирани еритроцити. Като индикатор се използва фенолово червено. Тъй като молекулите на въглеродната киселина се дисоциират, всички нови CO 2 молекули претърпяват ензимна хидратация. За да се получат сравними резултати, реакцията винаги трябва да протича при една и съща температура; най-удобно е температурата на топящия се лед да се поддържа на 0°. Контролното време за реакция (спонтанна реакция на CO 2 хидратация) обикновено е 110-125 с. Обикновено, когато се определя по този метод, активността на К. е средно равна на 2-2,5 конвенционални единици, а по отношение на 1 милион червени кръвни клетки, 0,458 ± 0,006 конвенционални единици (взема се единица активност на К. да бъде 2-кратно увеличение на скоростта на катализираната реакция).

Библиография:Клинична оценка на лабораторните изследвания, изд. ДОБРЕ. Тица, пер. от английски, стр. 196, М., 1986.

II Карбоанхидраза

- ензим, който катализира обратимата реакция на образуване на въглеродна киселина от въглероден диоксид и вода. K инхибиторите се използват в медицината за лечение на някои сърдечно-съдови и други заболявания...
Естествени науки. енциклопедичен речник
- I Карбоанхидразата е ензим, който катализира обратимата реакция на хидратация на въглероден диоксид: CO2 + H2O ⇔ H2CO3 ⇔ H+ + HCO3...
Медицинска енциклопедия
- цинк-съдържащ ензим от групата на въглерод-кислородната лиаза, катализиращ обратимата реакция на разцепване на въглеродна киселина до въглероден диоксид и вода...
Голям медицински речник
- карбоанхидраза, карбонатна хидролиза, ензим от класа на лиазите, катализиращ обратимото образуване на въглена киселина от въглероден диоксид и вода: CO2 + H2O ↔ H2CO3. K. е металопротеин, съдържащ Zn...

Целта на работата е да се определят факторите, влияещи върху активността на цинк-съдържащата карбоанхидраза в репродуктивната система на мъжки плъхове при условия на излагане на нискоинтензивно микровълново лъчение. Карбоанхидразата играе важна роля в метаболизма на семенната плазма и узряването на спермата. Карбоанхидразна активност във водно-солеви екстракти от епидидими и тестиси на плъхове в контролната група, според нашите данни, варира от 84,0 ± 74,5 U/ml, което по отношение на тъканното тегло е 336,0 ± 298,0 U/mg. Изследвана е връзката между концентрацията на цинкови и полиаминови йони и активността на карбоанхидразата. Активността на карбоанхидразата в репродуктивната система на мъжки плъхове има сложна схема на регулиране, която очевидно не се ограничава до факторите, които описахме. Въз основа на получените резултати може да се заключи, че ролята на различните регулатори на активността на този ензим варира в зависимост от степента на активност на карбоанхидразата. Вероятно високите концентрации на спермин ограничават транскрипцията на гена на карбоанхидразата, предвид данните за функциите на този полиамин. Спермидинът вероятно служи като ограничаващ фактор в посттрибозомните етапи на регулиране на активността на карбоанхидразата, а путресцинът и концентрацията на цинкови йони са взаимосвързани фактори на активиране.

репродуктивна система на мъжки плъхове

концентрация на цинкови йони

полиамини

карбоанхидраза

1. Бойко О.В. Методологични аспекти на използването на спермин и спермидин на солна киселина за идентифициране на уропатогенна микрофлора / O.V. Бойко, А.А. Терентьев, А.А. Николаев // Проблеми на възпроизводството. – 2010. – № 3. – С. 77-79.

2. Илиина О.С. Промени в съдържанието на цинк в човешката кръв при захарен диабет тип I и характеристики на хипогликемичния ефект на съдържащия цинк инсулин-хондроитин сулфатен комплекс: резюме. дис. ...канд. биол. Sci. – Уфа, 2012. – 24 с.

3. Луцки Д.Л. Протеинов спектър на еякулати с различна плодовитост / D.L. Луцки, А.А. Николаев, Л.В. Ложкина // Урология. – 1998. – № 2. – С. 48-52.

4. Николаев А.А. Активност на спермоплазмените ензими в еякулати с различна фертилност / A.A. Николаев, Д.Л. Луцки, В.А. Бочановски, Л.В. Ложкина // Урология. – 1997. – № 5. – С. 35.

5. Плосконос М.В. Определяне на полиамини в различни биологични обекти / M.V. Плосконос, А.А. Николаев, А.А. Николаев // Астраханска държава. пчелен мед. акад. – Астрахан, 2007. – 118 с.

6. Полунин А.И. Използването на цинк при лечението на мъжкия субфертилитет / A.I. Полунин, В.М. Мирошников, А.А. Николаев, В.В. Думченко, Д.Л. Луцки // Микроелементи в медицината. – 2001. – Т. 2. – № 4. – С. 44-46.

7. Haggis G.C., Gortos K. Карбоанхидразна активност на тъканите на репродуктивния тракт на мъжки плъхове и нейната връзка с производството на сперма // J. Fert. Възпроизвеждане – 2014. - Т. 103. - С. 125-130.

Известно е, че активността на цинк-съдържащата карбоанхидраза е висока в репродуктивната система на мъжки птици, бозайници и хора. Активността на този ензим влияе върху узряването на сперматозоидите, техния брой и обем. Но няма информация за промени в активността на карбоанхидразата под влияние на други постоянни компоненти на репродуктивната система, като цинкови йони и полиамини (путресцин, спермин и спермидин), които активно влияят върху сперматогенезата. Дадено само основни характеристикипоследици от промените в активността на карбоанхидразата върху морфофункционалното състояние на органите на репродуктивната система на мъжки плъхове, броя на сперматозоидите, тяхната подвижност.

Целта на нашата работае изследване на активността на съдържащата цинк карбоанхидраза и нейната връзка с нивото на полиамини и цинкови йони в тъканта на репродуктивната система на зрели мъжки плъхове.

Материали и методи. Експерименталната част от изследването включва 418 мъжки плъхове албиноси Wistar. Плъховете са на възраст 6-7 месеца (зрели индивиди). Телесното тегло на плъховете е 180-240 g, държани при стандартни условия на вивариум. За да се избегне влиянието на сезонните разлики в отговорите на експерименталните влияния, всички изследвания са проведени през есенно-зимния период на годината. Събирането на тестиси и епидидими от плъхове се извършва под етерна анестезия ( експериментални изследванияса извършени в строго съответствие с Декларацията от Хелзинки за хуманното отношение към животните).

Обект на нашето изследване бяха водно-солеви екстракти от епидидими и тестиси на полово зрели мъжки бели плъхове. Екстрактите се приготвят в буфер на трис-солна киселина рН = 7,6 в съотношение тегло/обем 1/5, след четирикратно замразяване, размразяване и центрофугиране при 8000 g за 50 минути, пробите се замразяват и съхраняват при -24 °C до ученето.

Определяне на цинк. Към 2 ml от изследвания екстракт се добавят 0,1 ml 10% NaOH и 0,2 ml 1% разтвор на дитизон в тетрахлорметан. В отрицателната контрола се добавят 2 ml дестилирана вода, в положителната контрола - 2 ml 20 μmol разтвор на цинков сулфат (моларна концентрация на стандартен разтвор на цинков сулфат). Пробите бяха фотометрирани при 535 nm. Концентрацията на цинкови катиони в пробата се изчислява по формулата: CZn=20 µmol × Проба OD535/Стандартна OD535, където Проба OD535 е оптичната плътност на пробата, измерена при 535 nm; OD535 Standard - оптична плътност на стандартен 20 микромоларен разтвор на цинков сулфат, измерена при 535 nm.

Определяне на карбоанхидраза. Методът се основава на реакцията на дехидратация на бикарбонат с отстраняване на въглеродния диоксид, образуван в резултат на дехидратация с интензивно барботиране на реакционната среда с въздух, освободен от въглероден оксид, и едновременно записване на скоростта на промяна на рН. Реакцията се инициира чрез бързо въвеждане на разтвор на субстрата - натриев бикарбонат (10 mM) в реакционната смес, съдържаща тестовата проба. В този случай pH се повишава с 0,01-0,05 единици. Проби (10.0-50.0 mg) от епидидимис и тестиси на полово зрели мъжки бели плъхове се хомогенизират и центрофугират при 4500 g за 30 минути. при 4 °C и супернатантата се разрежда с двойно дестилирана вода при 4 °C до обем, който би позволил измерването на реакционното време. Активността на карбоанхидразата се определя от промяната в първоначалната стойност на рН от 8,2 до 8,7 в реакцията на дехидратация на CO2. Скоростта на натрупване на хидроксилни йони се измерва електрометрично с помощта на чувствителен програмируем pH метър (InoLab pH 7310), свързан с компютър. Промяната на рН от 8,2 до 8,7, като функция на времето в линейния участък, взема предвид ензимната активност. Изчислено е средното време (T) за 4 измервания. Времето на промяна на рН по време на спонтанна хидратация на CO2 в среда без проба се приема като контрола. Активността на карбоанхидразата се изразява в ензимни единици (U) на mg мокра тъкан съгласно уравнението: ED = 2 (T0 - T)/ (T0 × mg тъкан в реакционната смес), където T0 = средно време за 4 измервания на чист разтвор от 4 ml охладен, наситен въглероден диоксид, бидестилирана вода.

Определяне на полиамини. Проби (100–200 mg) от епидидимис и тестиси на зрели мъжки плъхове албиноси се хомогенизират, суспендират се в 1 ml 0,2 нормална перхлорна киселина за извличане на свободни полиамини и се центрофугират. Към 100 μl от супернатантата се добавят 110 μl 1.5 M натриев карбонат и 200 μl дансил хлорид (7.5 mg/ml разтвор в ацетон; Sigma, Мюнхен, Германия). В допълнение, 10 μL от 0,5 mM диаминохексан се добавят като вътрешен стандарт. След 1 h инкубиране при 60°C на тъмно, 50 μL разтвор на пролин (100 mg/mL) се добавят за свързване на свободния дансил хлорид. След това дансилови производни на полиамини (наричани по-долу DNSC-полиамини) се екстрахират с толуен, сублимират се във вакуумен изпарител и се разтварят в метанол. Хроматографията се извършва на колона LC 18 с обърната фаза (Supelco), в система за течна хроматография с висока ефективност (Dionex), състояща се от градиентен миксер (модел P 580), автоматичен инжектор (ASI 100) и флуоресцентен детектор (RF 2000) . Полиамините се елуират в линеен градиент от 70% до 100% (v/v) метанол във вода при скорост на потока от 1 mL/min и се откриват при дължина на вълната на възбуждане от 365 nm и дължина на вълната на излъчване от 510 nm. Данните бяха анализирани с помощта на софтуер Dionex Chromeleon, а количественото определяне беше извършено с калибрационни криви, получени от смес от чисти вещества (фиг. A).

Високоефективна хроматография на DNSC полиамини:

А - хроматограма на стандартна смес от DNSC-полиамини; B - хроматограма на DNSC-полиамини от една от тъканните проби на епидидима и тестисите на мъжки плъхове. 1 - путресцин; 2 - кадаверин; 3 - хександиамин (вътрешен стандарт); 4 - спермидин; 5 - сперматозоиди. Оста x е времето в минути, оста y е флуоресценцията. Неномерирани пикове - неидентифицирани примеси

Резултати от изследването и дискусия. Както е известно, карбоанхидразата играе важна роля в метаболизма на семенната плазма и узряването на спермата. Карбоанхидразна активност във водно-солеви екстракти от епидидими и тестиси на плъхове в контролната група, според нашите данни, варира от 84,0 ± 74,5 U/ml, което по отношение на тъканното тегло е 336,0 ± 298,0 U/mg. Такава висока активност на ензима може да се обясни с неговата важна физиологична роля. За сравнение, нивото на активност на този ензим в други тъкани на същите животни е много по-ниско (Таблица 1), с изключение на цяла кръв, в която е известна висока активност на еритроцитната карбоанхидраза. Въпреки това, това, което заслужава да се отбележи, е много голямото разсейване в стойностите на активността на карбоанхидразата в епидидима и тестисите, чийто коефициент на вариация е повече от 150% (Таблица 1).

маса 1

Карбоанхидразна активност в тъкани на полово зрели мъже

Тъкан на мъжки плъх	Ензимна активност, единици	Брой наблюдения	Коефициентът на вариация, %


мозъчна тъкан
Мускул
Лигавица на стомашно-чревния тракт
епидидим и тестиси
Пълна кръв

Това показва влиянието на неотчетени фактори върху активността на ензима. Има две обстоятелства, които обясняват тази особеност. Първо, известно е, че биологично активните амини, включително полиамините спермидин и спермин, са способни да активират карбоанхидразата. Мъжката репродуктивна система е най-богатият източник на спермин и спермидин. Затова задържахме паралелно определениеконцентрации на полиамини във водно-солеви екстракти от епидидими и тестиси на мъжки плъхове. Полиамините спермидин, спермин и путресцин се анализират чрез HPLC, както е описано в Методи. Показано е, че спермин, спермидин и путресцин са открити в тъканта на епидидимиса и тестисите на мъжки плъхове (фиг. B).

При здрави полово зрели мъжки плъхове нивото на спермин е 5.962±4.0.91 µg/g тъкан, спермидин 3.037±3.32 µg/g тъкан, путресцин 2.678±1.82 µg/g тъкан и съотношението спермин/спермидин 1.88- 2.91. Освен това, според нашите данни, както нивото на спермидин, така и нивото на спермин (в по-малка степен) са обект на значителни колебания. Корелационният анализ показа значителна положителна връзка (r=+0.3) между нивата на спермин и спермидин, и съответно спермидин и путресцин (r=+0.42). Очевидно това обстоятелство е един от факторите, влияещи върху високата дисперсия на резултатите от определянето на активността на карбоанхидразата.

Друг регулатор на активността на карбоанхидразата може да бъде нивото на цинк в репродуктивната тъкан на полово зрели мъжки плъхове. Според нашите данни нивото на цинковия йон варира в широки граници от 3,2 до 36,7 μg/g тъкан от общия препарат на тестисите и епидидима на полово зрели мъжки плъхове.

Корелационният анализ на нивата на цинк с нивата на активността на спермин, спермидин и карбоанхидраза показва различни нива на положителна корелация между концентрацията на цинкови йони и тези метаболити. Установено е незначително ниво на връзка със спермин (+0,14). Предвид броя на използваните наблюдения, тази корелация не е значима (p≥0,1). Установена е значителна положителна корелация между нивото на цинковите йони и концентрацията на путресцин (+0,42) и концентрацията на спермидин (+0,39). Установена е и очаквано висока положителна корелация (+0,63) между концентрацията на цинкови йони и активността на карбоанхидразата.

На следващия етап се опитахме да комбинираме концентрацията на цинк и нивото на полиамините като фактори, регулиращи активността на карбоанхидразата. При анализа на вариационните серии на съвместното определяне на концентрацията на цинкови йони, полиамини и карбоанхидразна активност бяха разкрити някои закономерности. Показано е, че от 69 изследвания, проведени върху нивото на карбоанхидразна активност, могат да бъдат разграничени три групи:

Група 1 - висока активност от 435 до 372 единици (брой наблюдения 37),

Група 2 - ниска активност от 291 до 216 единици (брой наблюдения 17),

Група 3 - много ниска активност от 177 до 143 единици (брой наблюдения 15).

При класирането на нивата на полиамини и концентрацията на цинкови йони с тези групи беше разкрита интересна характеристика, която не се появи при анализа на вариационните серии. Максималните концентрации на спермин (средно 9,881±0,647 μg/g тъкан) са свързани с третата група наблюдения с много ниска карбоанхидразна активност, а минималните (средно 2,615±1,130 μg/g тъкан) с втората група с ниска ензимна активност.

Най-голям брой наблюдения се свързват с първата група с високо нивокарбоанхидразна активност, в тази група концентрациите на спермин са близки до средните стойности (средно 4,675 ± 0,725 μg/g тъкан).

Концентрацията на цинкови йони показва сложна връзка с активността на карбоанхидразата. В първата група на карбоанхидразна активност (Таблица 2) концентрацията на цинкови йони също е по-висока от стойностите в другите групи (средно 14,11±7,25 μg/g тъкан). Освен това концентрацията на цинковите йони намалява в съответствие с намаляването на активността на карбоанхидразата, но това намаление не е пропорционално. Ако във втората група активността на карбоанхидразата намалява в сравнение с първата с 49,6%, а в третата с 60,35%, то концентрацията на цинкови йони намалява във втората група с 23%, а в третата с 39%.

таблица 2

Връзката между концентрацията на полиамини и цинкови йони и активността на карбоанхидразата

Групи за дейности карбоанхидраза, единици	Средна концентрация спермин, µg/g тъкан	Средна концентрация спермидин, µg/g тъкан	Средна концентрация путресцин, µg/g тъкан	Средна концентрация цинкови йони, µg/g тъкан

Това показва допълнителни фактори, влияещи върху активността на този ензим. Динамиката на концентрацията на путресцин изглежда малко по-различна (Таблица 2). Нивото на този полиамин пада с по-бързи темпове, а в третата сравнителна група нивото на путресцин е по-ниско средно с почти 74%. Динамиката на нивата на спермидин се различава по това, че "изскачащите" стойности на концентрация на този полиамин са свързани предимно с втората група нива на активност на карбоанхидразата. При висока активност на този ензим (група 1) концентрацията на спермидин е малко по-висока от средната за всички наблюдения, а в третата група е почти 4 пъти по-ниска от концентрацията във втората група.

По този начин, активността на карбоанхидразата в репродуктивната система на мъжки плъхове има сложна схема на регулиране, която очевидно не се ограничава до факторите, които описахме. Въз основа на получените резултати може да се заключи, че ролята на различните регулатори на активността на този ензим варира в зависимост от степента на активност на карбоанхидразата. Вероятно високите концентрации на спермин ограничават транскрипцията на гена на карбоанхидразата, предвид данните за функциите на този полиамин. Спермидинът вероятно служи като ограничаващ фактор в посттрибозомните етапи на регулиране на активността на карбоанхидразата, а путресцинът и концентрацията на цинкови йони са взаимосвързани фактори на активиране.

При тези условия оценката на влиянието на външни фактори (включително тези, които променят репродуктивната функция) върху активността на карбоанхидразата, като една от важните връзки в метаболизма на репродуктивната система на мъжките бозайници, става не само важна, но и доста важна сложен процес, изискващ голям брой контроли и многостранна оценка.

Библиографска връзка

Кузнецова М.Г., Ушакова М.В., Гудинская Н.И., Николаев А.А. РЕГУЛИРАНЕ НА АКТИВНОСТТА НА ЦИНК-СЪДЪРЖАЩАТА КАРБОНАНХИДРАЗА В РЕПРОДУКТИВНАТА СИСТЕМА НА МЪЖКИ ПЛЪХОВЕ // Съвременни въпросинаука и образование. – 2017. – № 2.;
URL: http://site/ru/article/view?id=26215 (дата на достъп: 19.07.2019 г.).