Структура и химия на хроматина
| Име на параметъра | Значение |
| Тема на статията: | Структура и химия на хроматина |
| Рубрика (тематична категория) | Екология |
Хроматинът, основният компонент на клетъчното ядро, се получава доста лесно от изолирани интерфазни ядра и от изолирани митотични хромозоми. За да направят това, те използват способността му да преминава в разтворено състояние по време на екстракция с водни разтвори с ниска йонна сила или просто дейонизирана вода. В този случай участъци от хроматин набъбват и се превръщат в гел. За да се превърнат такива лекарства в истински разтвори, са необходими силни механични въздействия: разклащане, разбъркване, допълнителна хомогенизация. Това, разбира се, води до частично разрушаване на оригиналната структура на хроматина, раздробяването му на малки фрагменти, но практически не променя химичния му състав.
Хроматиновите фракции, получени от различни обекти, имат доста еднакъв набор от компоненти. Установено е, че общият химичен състав на хроматина от интерфазните ядра и митотичните хромозоми се различава малко един от друг. Основните компоненти на хроматина са ДНК и протеини, по-голямата част от които са хистони и нехистонови протеини (вижте таблица 3).
Таблица 3. Химичен съставхроматин. Съдържанието на протеин и РНК е дадено спрямо ДНК
Средно около 40% от хроматина е ДНК и около 60% са протеини, сред които специфичните ядрени хистонови протеини съставляват от 40 до 80% от всички протеини, които изграждат изолирания хроматин. Освен това хроматиновата фракция включва мембранни компоненти, РНК, въглехидрати, липиди и гликопротеини. Въпросът доколко тези второстепенни компоненти са включени в структурата на хроматина все още не е разрешен. Така например РНК може да бъде транскрибирана РНК, която все още не е загубила връзката си с ДНК шаблона. Други второстепенни компоненти могат да представляват вещества от коутаени фрагменти от ядрената мембрана.
Структурно, хроматинът е нишковиден комплекс от дезоксирибонуклеопротеинови (DNP) молекули, които се състоят от ДНК, свързана с хистони (виж Фиг. 57). Поради тази причина се е утвърдило друго име за хроматин: нуклеохистон. Това се дължи на свързването на хистони с ДНК, че се образуват много лабилни, променливи комплекси нуклеинова киселина-хистон, където съотношението ДНК:хистон е приблизително едно, ᴛ.ᴇ. те присъстват в равни тегловни количества. Тези нишковидни DNP фибрили са елементарни хромозомни или хроматинови нишки, чиято дебелина, в зависимост от степента на пакетиране на ДНК, може да варира от 10 до 30 nm. Тези DNP фибрили могат от своя страна да бъдат допълнително уплътнени, за да образуват повече високи ниваструктуриране на DNP, до митотичната хромозома. Ролята на някои нехистонови протеини е именно в образуването на високи нива на уплътняване на хроматина.
Хроматинова ДНК.В хроматиновия препарат ДНК обикновено представлява 30-40%. Тази ДНК е двуверижна спирална молекула, подобна на чистата изолирана ДНК във водни разтвори. Това се доказва от много експериментални данни. По този начин, когато разтворите на хроматин се нагряват, се наблюдава повишаване на оптичната плътност на разтвора, така нареченият хиперхромен ефект, свързан с разкъсването на междунуклеотидните водородни връзки между ДНК веригите, подобно на това, което се случва, когато чистата ДНК се нагрява (стопи) .
Въпросът за размера и дължината на ДНК молекулите в хроматина е важен за разбирането на структурата на хромозомата като цяло. Използвайки стандартни методи за екстракция, хроматиновата ДНК има молекулно тегло 7-9 x 106, което е значително по-малко от молекулното тегло на ДНК от Escherichia coli (2,8 x 109). Такова относително ниско молекулно тегло на ДНК от хроматинови препарати може да се обясни с механично увреждане на ДНК по време на процеса на изолиране на хроматин. Ако ДНК се изолира при условия, които изключват разклащане, хомогенизиране и други влияния, е възможно да се получат много дълги ДНК молекули от клетките. Дължината на ДНК молекулите от ядрата и хромозомите на еукариотните клетки трябва да се изследва с помощта на метода на светлинно-оптична авторадиография, точно както е изследвано върху прокариотни клетки.
Установено е, че в рамките на хромозомите дължината на отделните линейни (за разлика от прокариотните хромозоми) ДНК молекули може да достигне стотици микрометри и дори няколко сантиметра. По този начин, ДНК молекули с размери от 0,5 mm до 2 cm са получени от различни обекти. Тези резултати показват, че има тясно съответствие между изчислената дължина на ДНК на хромозома и авторадиографското наблюдение.
След лек лизис на еукариотни клетки, молекулните тегла на ДНК могат да бъдат директно определени чрез физикохимични методи. Доказано е, че максималното молекулно тегло на ДНК молекула на Drosophila е 41 x 109, което съответства на дължина от около 2 cm. При някои дрожди има ДНК молекула на хромозома с молекулно тегло 1 x 108-109. , който е с размери около 0,5 мм.
Такава дълга ДНК се състои от една единствена молекула, а не от няколко по-къси, зашити заедно в един файл с помощта на протеинови връзки, както вярваха някои изследователи. До този извод се стигна, след като се оказа, че дължината на ДНК молекулите не се променя след третиране на лекарства с протеолитични ензими.
Общото количество ДНК, включено в ядрените структури на клетките, в генома на организмите, варира от вид на вид, въпреки че при микроорганизмите количеството ДНК на клетка е значително по-ниско, отколкото при безгръбначните, висшите растения и животните. Така една мишка има почти 600 пъти повече ДНК на ядро от Е. coli. Когато се сравнява количеството ДНК на клетка в еукариотните организми, е трудно да се установи някаква връзка между степента на сложност на организма и количеството ДНК на ядро. Такива различни организми като лен, морски таралеж, костур (1,4-1,9 pg) или овъглен и бик (6,4 и 7 pg) имат приблизително еднакво количество ДНК.
Има значителни колебания в количеството на ДНК в големи таксономични групи. Сред висшите растения количеството ДНК в различни видовеможе да се различава стотици пъти, точно както сред рибите количеството на ДНК при земноводните се различава десетки пъти.
Някои земноводни имат 10-30 пъти повече ДНК в ядрата си, отколкото в човешките ядра, въпреки че генетичната конституция на хората е несравнимо по-сложна от тази на жабите. Следователно може да се предположи, че „прекомерното“ количество ДНК в по-ниско организираните организми или не е свързано с изпълнението на генетична роля, или броят на гените се повтаря един или друг брой пъти.
Таблица 4. Съдържание на ДНК в клетките на някои обекти (pg, 10 -12 g)
Оказа се, че е възможно да се решат тези проблеми чрез изучаване на кинетиката на реакцията на ренатурация или хибридизация на ДНК. Ако фрагментираните ДНК молекули в разтвори се подложат на термична денатурация и след това се инкубират при температура, малко по-ниска от тази, при която се извършва денатурацията, тогава първоначалната двойноверижна структура на ДНК фрагментите се възстановява поради повторното обединяване на комплементарни вериги - ренатурация. За ДНК вируси и прокариотни клетки беше показано, че скоростта на такава ренатурация директно зависи от размера на генома; колкото по-голям е геномът, толкова повече количествоДНК на частица или клетка, толкова повече време е необходимо за случайния подход на комплементарни вериги и специфичното повторно свързване на по-голям брой ДНК фрагменти, различни по нуклеотидна последователност (фиг. 53). Характерът на кривата на реасоцииране на ДНК на прокариотните клетки показва липсата на повтарящи се базови последователности в прокариотния геном; всички участъци от тяхната ДНК носят уникални последователности, чийто брой и разнообразие отразяват степента на сложност на генетичния състав на обектите и, следователно, тяхната обща биологична организация.
Напълно различна картина на реасоциацията на ДНК се наблюдава при еукариотните организми. Оказа се, че тяхната ДНК съдържа фракции, които се ренатурират с много по-висока скорост, отколкото би се очаквало въз основа на размера на техния геном, както и фракция от ДНК, която се ренатурира бавно, като уникалните ДНК последователности на прокариотите. В същото време еукариотите изискват много повече време, за да ренатурират тази фракция, което е свързано с общия голям размер на техния геном и голям брой различни уникални гени.
В тази част от еукариотната ДНК, която се характеризира с висока степен на ренатурация, се разграничават две подфракции: 1) фракция с много или често повтарящи се последователности, където подобни ДНК участъци се повтарят 106 пъти; 2) фракция от умерено повтарящи се последователности, срещащи се 102-103 пъти в генома. Така при мишки фракцията на ДНК с често повтарящи се последователности включва 10% от общото количество ДНК на геном и 15% се отчитат от фракцията с умерено повтарящи се последователности. Останалите 75% от цялата миша ДНК е представена от уникални региони, съответстващи на голям брой различни неповтарящи се гени.
Фракциите с често повтарящи се последователности могат да имат различна плаваща плътност от по-голямата част от ДНК и следователно могат да бъдат изолирани в чиста форма като така наречените сателитни ДНК фракции. При мишката тази фракция е с плътност 1,691 g/ml, а основната част от ДНК е 1,700 g/ml. Тези разлики в плътността се определят от разликите в нуклеотидния състав. Например, в една мишка има 35% G и C двойки в тази фракция и 42% в основния пик на ДНК.
Както се оказа, сателитната ДНК или фракцията на ДНК с често повтарящи се последователности не участва в синтеза на основните видове РНК в клетката и не е свързана с процеса на синтез на протеини. Това заключение е направено въз основа на факта, че нито един от видовете клетъчна РНК (tRNA, mRNA, rRNA) не хибридизира със сателитна ДНК. Следователно, тези ДНК не съдържат последователности, отговорни за синтеза на клетъчна РНК, ᴛ.ᴇ. сателитните ДНК не са матрици за синтеза на РНК и не участват в транскрипцията.
Има хипотеза, че много повтарящи се последователности, които не са пряко включени в протеиновия синтез, могат да носят информация, която играе важна структурна роля в поддържането и функционирането на хромозомите. Те включват множество участъци от ДНК, свързани с основните протеини на интерфазното ядро (виж по-долу), места, където започва репликацията или транскрипцията, както и участъци от ДНК, които регулират тези процеси.
Локализацията на тази фракция е изследвана с помощта на метода на хибридизация на нуклеинова киселина директно върху хромозоми (in situ). За да се направи това, РНК, белязана с 3Н-уридин, се синтезира върху изолирана сателитна ДНК с помощта на бактериални ензими. След това цитологичният препарат с хромозоми се подлага на обработка, която предизвиква денатурация на ДНК (повишена температура, алкална среда и др.). След това върху препарата се поставя 3H-маркирана РНК и се постига хибридизация между ДНК и РНК. Авторадиографията показва, че по-голямата част от етикета е локализирана в зоната на първичните стеснения на хромозомите, в зоната на техните центромерни области. Белегът се открива и в други региони на хромозомите, но много слабо (фиг. 54).
През последните 10 години бяха направени големи крачки в изследването на центромерната ДНК, особено в клетките на дрождите. Така, в S. cerevisiae, центромерната ДНК се състои от повтарящи се участъци от 110 bp. Състои се от две запазени области (I и III) и централен елемент (II), обогатен с AT базови двойки. Хромозомите на Drosophila имат подобна центромерна ДНК структура. Човешка центромерна ДНК (алфоидна сателитна ДНК) се състои от тандем от 170 bp мономери, организирани в групи от димери или пентамери, които от своя страна образуват големи последователности 1-6 x 103 bp. Тази най-голяма единица се повтаря 100-1000 пъти. Специални центромерни протеини са комплексирани с тази специфична центромерна ДНК и участват в образуването на кинетохора, структура, която осигурява връзката на хромозомите с вретеновидни микротубули и в движението на хромозомите в анафаза (вижте по-долу).
ДНК със силно повтарящи се последователности също се намира в теломерните региони на хромозомите на много еукариотни организми (от дрожди до хора). Тук най-често се срещат повторения, които включват 3-4 гуанинови нуклеотида. При хората теломерите съдържат 500-3000 TTAGGG повторения. Тези участъци от ДНК изпълняват специална роля - да ограничат краищата на хромозомата и да предотвратят нейното скъсяване по време на процеса на повторна репликация.
Наскоро беше установено, че силно повтарящи се ДНК последователности на интерфазни хромозоми се свързват специфично с ламинови протеини, лежащи в основата на ядрената обвивка и участват в закрепването на разширени декондензирани интерфазни хромозоми, като по този начин определят реда в локализацията на хромозомите в обема на интерфазното ядро.
Предполага се, че сателитната ДНК може да участва в разпознаването на хомоложните области на хромозомите по време на мейозата. Според други предположения регионите с често повтарящи се последователности играят ролята на разделители (спейсъри) между различни функционални единици на хромозомна ДНК, например между репликони (виж по-долу).
Както се оказа, частта от умерено повтарящи се (от 102 до 105 пъти) последователности принадлежи към разнообразен клас от ДНК региони, които играят важна роля в процесите на създаване на апарата за синтез на протеини. Тази фракция включва рибозомни ДНК гени, които се повтарят в различни видове от 100 до 1000 пъти. Тази фракция включва многократно повтарящи се региони за синтеза на всички тРНК. Освен това някои структурни гени, отговорни за синтеза на определени протеини, също се повтарят многократно и са представени в много копия. Това са гените за хроматиновите протеини - хистони, повтарящи се до 400 пъти.
В същото време тази фракция включва ДНК участъци с различни последователности (100-400 нуклеотидни двойки всяка), също многократно повтарящи се, но разпръснати из целия геном. Тяхната роля все още не е напълно ясна. Предполага се, че такива ДНК участъци могат да представляват акцепторни или регулаторни области на различни гени.
И така, ДНК на еукариотните клетки е хетерогенна по състав, съдържаща няколко класа нуклеотидни последователности: често повтарящи се последователности (> 106 пъти), включени в сателитната ДНК фракция и нетранскрибирани; фракция от умерено повтарящи се последователности (102-105), представляващи блокове от истински гени, както и къси последователности, разпръснати из целия геном; част от уникални последователности, които носят информация за повечето клетъчни протеини.
Въз основа на тези идеи стават ясни разликите в количеството ДНК, които се наблюдават в различните организми: те са свързани с неравномерно съотношение на определени класове ДНК в генома на организмите. Така например при земноводните Amphiuma (които имат 20 пъти повече ДНК, отколкото при хората), повтарящите се последователности представляват до 80% от общата ДНК, при лука - до 70, при сьомгата - до 60% и т.н. . Истинското богатство на генетична информация трябва да бъде отразено от частта от уникални последователности. Не трябва да забравяме, че в естествената, нефрагментирана ДНК молекула на хромозомата, всички участъци, които включват уникални, умерено и често повтарящи се последователности, са свързани в една гигантска ковалентна ДНК верига.
ДНК молекулите са хетерогенни не само в области на различни нуклеотидни последователности, но също така се различават по своята синтетична активност.
Репликация на еукариотна ДНК.Бактериалната хромозома се репликира като една структурна единица, имаща една начална точка на репликация и една крайна точка. Така бактериалната кръгова ДНК е един репликон. От началната точка репликацията протича в две противоположни посоки, така че докато се синтезира ДНК, се образува така нареченото репликационно око, ограничено от двете страни с репликационни вилици, което се вижда ясно по време на електронно микроскопско изследване на вирусни и бактериални репликиращи се хромозоми .
В еукариотните клетки организацията на репликация е от различно естество - полирепликон Както вече беше споменато, с импулсното включване на 3НТ се появява множествен етикет в почти всички митотични хромозоми. Това означава, че едновременно има много места за репликация и много автономни източници на репликация в интерфазната хромозома. Това явление е изследвано по-подробно с помощта на авторадиография на белязани молекули, изолирани от ДНК (фиг. 55). под формата на пунктирани линии. Това са малки участъци от ДНК, които са успели да се репликират, а между тях има участъци от нерепликирана ДНК, която не е напуснала авторадиограф и следователно остава невидима. С увеличаването на времето за контакт на 3HT с клетката размерът на тези сегменти се увеличава и разстоянието между тях намалява. От тези експерименти скоростта на репликация на ДНК в еукариотните организми може да бъде точно изчислена. Скоростта на движение на вилицата за репликация се оказа 1-3 kb. на минута при бозайници, около 1 kb. на минута в някои растения, което е много по-ниско от скоростта на репликация на ДНК в бактерии (50 kb на минута). В същите експерименти беше пряко доказана полирепликонната структура на ДНК на еукариотните хромозоми: по дължината на хромозомната ДНК, по протежение на нея, има много независими места за репликация - репликони. Чрез разстоянието между средните точки на съседни маркиращи репликони, ᴛ.ᴇ. По разстоянието между две съседни начални точки на репликация можете да разберете размера на отделните репликони. Средно размерът на репликона на висшите животни е около 30 µm или 100 kbp. Следователно трябва да има 20 000-30 000 репликони в хаплоидния набор от бозайници. При нисшите еукариоти репликоните са по-малки, около 40 kb. Така при Drosophila има 3500 репликона на геном, а при дрождите – 400. Както беше споменато, синтезът на ДНК в репликона протича в две противоположни посоки. Това може лесно да се докаже чрез авторадиография: ако на клетките, след импулсно маркиране, се позволи да продължат да синтезират ДНК за известно време в среда без 3НТ, тогава включването му в ДНК ще намалее, ще настъпи разреждане на етикета и върху авторадиограф ще бъде възможно да се види симетрично, от двете страни на репликирания регион, намалявайки броя на зърната от редуцирано сребро.
Репликиращите се краища или разклонения в репликон спират да се движат, когато срещнат разклоненията на съседни репликони (в крайна точка, обща за съседните репликони). В този момент репликираните участъци от съседни репликони се комбинират в единични ковалентни вериги от две новосинтезирани ДНК молекули. Функционалното разделяне на хромозомната ДНК на репликони съвпада със структурното разделяне на ДНК на домени или бримки, чиито основи, както вече беше споменато, се държат заедно чрез протеинови връзки.
По този начин целият синтез на ДНК на една хромозома възниква поради независим синтез на много отделни репликони, последван от свързване на краищата на съседни ДНК сегменти. Биологичният смисъл на това свойство става ясен при сравняване на синтеза на ДНК при бактерии и еукариоти. Така се синтезира бактериална монорепликонна хромозома с дължина 1600 микрона със скорост около половин час. Ако една сантиметър дълга ДНК молекула на хромозома на бозайник също се репликира като структура на монорепликон, това ще отнеме около седмица (6 дни). Но ако такава хромозома съдържа няколкостотин репликони, тогава нейната пълна репликация ще отнеме само около час. Всъщност времето за репликация на ДНК при бозайниците е 6-8 часа. Това се дължи на факта, че не всички репликони на определена хромозома се включват по едно и също време.
В някои случаи се наблюдава едновременно включване на всички репликони или появата на допълнителни източници на репликация, което прави възможно завършването на синтеза на всички хромозоми за минимално кратко време. Това явление възниква в началото на ембриогенезата на някои животни. Известно е, че при смачкване на яйцата на ноктестата жаба Xenopus laevis синтезът на ДНК отнема само 20 минути, докато в културата на соматичните клетки този процес продължава около един ден. Подобна картина се наблюдава при Drosophila: в ранните ембрионални стадии целият синтез на ДНК в ядрото отнема 3,5 минути, а в клетките на тъканната култура - 600 минути. В същото време размерът на репликоните в клетките на културата се оказа почти 5 пъти по-голям, отколкото в ембрионите.
Синтезът на ДНК по дължината на отделна хромозома се извършва неравномерно. Установено е, че в отделна хромозома активните репликони се събират в групи, репликативни единици, които включват 20-80 източника на репликация. Това следва от анализа на ДНК автографи, където се наблюдава точно такова блокиране на репликиращи се сегменти. Друга основа за идеята за съществуването на блокове или клъстери от репликони или репликационни единици са експерименти с включването на тимидинов аналог, 5'-бромодеоксиуридин (BrdU), в ДНК. Включването на BrdU в интерфазния хроматин води до факта, че по време на митоза областите с BrdU се кондензират в по-малка степен (недостатъчна кондензация) от тези области, където е включен тимидин. Поради тази причина тези области на митотичните хромозоми, в които е включен BrdU, ще бъдат слабо оцветени по време на диференциалното оцветяване. Това прави възможно определянето на последователността на включване на BrdU, ᴛ.ᴇ, в синхронизирани клетъчни култури. последователността на синтеза на ДНК по дължината на една хромозома. Оказа се, че включването на прекурсора в големи участъци от хромозомата се случва. Включването на различни секции става строго последователно през S-периода. Всяка хромозома се характеризира с висока стабилност на реда на репликация по дължината си и има свой собствен специфичен модел на репликация.
Репликонните клъстери, обединени в репликационни единици, са свързани с протеини на ядрената матрица (виж по-долу), които заедно с репликационните ензими образуват т.нар. клъстерозомите са зони в интерфазното ядро, в които се осъществява синтеза на ДНК.
Редът, в който се активират репликационните единици, вероятно може да се определи от структурата на хроматина в тези региони. Така, например, зоните на конститутивния хетерохроматин (близо до центромера) обикновено се репликират в края на S-периода, също така, в края на S-периода, част от факултативния хетерохроматин се удвоява (например, Х-хромозомата); на женските бозайници). Последователността на репликация на хромозомни участъци корелира особено ясно във времето с модела на диференциално оцветяване на хромозомите: R-сегментите принадлежат към сегментите с ранна репликация, G-сегментите съответстват на хромозомните участъци с късна репликация. С-сегментите (центромерите) са местата на последната репликация.
Тъй като в различните хромозоми размерът и броят на различните групи от различно оцветени сегменти са различни, това създава картина на асинхронното начало и край на репликацията на различните хромозоми като цяло. Във всеки случай последователността на началото и края на репликацията на отделните хромозоми в набора не е произволна. Съществува строга последователност на възпроизвеждане на хромозоми по отношение на другите хромозоми в набора.
Продължителността на процеса на репликация на отделните хромозоми не зависи пряко от техния размер. Така големите човешки хромозоми от група А (1-3) са белязани през целия S-период, както и по-късите хромозоми от група В (4-5).
Синтезът на ДНК в еукариотния геном обаче започва почти едновременно на всички хромозоми на ядрото в началото на S-периода. Но в същото време последователното и асинхронно включване на различни репликони се случва както в различни части на хромозомите, така и в различни хромозоми. Последователността на репликация на определен регион на генома е строго определена генетично. Това последно твърдение се доказва не само от модела на включване на етикета в различни сегменти на S-периода, но и от факта, че има строга последователност на поява на пикове в чувствителността на определени гени към мутагени по време на S -Период.
Основните хроматинови протеини са хистони.Ролята на ДНК в състава както на интерфазните хромозоми (хроматин на интерфазното ядро), така и на митотичните хромозоми е съвсем ясна: съхранение и внедряване на генетична информация. Освен това, за да се изпълняват тези функции като част от интерфазните ядра, е изключително важно да има ясна структурна основа, която би позволила огромната дължина на ДНК молекулите да бъдат подредени в строг ред, така че процесите както на синтеза на РНК и репликацията на ДНК се извършва с определена времева последователност В интерфазното ядро концентрацията на ДНК достига 100 mg/ml (!). Средно интерфазното ядро на бозайниците съдържа около 2 m ДНК, което е локализирано в сферично ядро със среден диаметър около 10 μm. Това означава, че такава огромна маса ДНК трябва по някакъв начин да бъде сгъната с коефициент на опаковане от 1 x 103 - 1 x 104. И в същото време в ядрото трябва да се запази определен ред в подреждането на частично или напълно декондензирани хромозоми. . И освен това трябва да се реализират условията за правилното функциониране на хромозомите. Ясно е, че всички тези изисквания не могат да бъдат реализирани в безструктурна, хаотична система.
В клетъчното ядро водещата роля в организирането на подреждането на ДНК, в нейното уплътняване и в регулирането на функционалните натоварвания принадлежи на ядрените протеини. Както вече беше посочено, хроматинът е сложен комплекс от ДНК с протеини, дезоксирибонуклеопротеин (DNP), където протеините представляват около 60% от сухото тегло. Протеините в хроматина са много разнообразни, но могат да бъдат разделени на две групи: хистони и нехистонови протеини. Хистоните представляват до 80% от всички хроматинови протеини. Тяхното взаимодействие с ДНК се осъществява чрез солеви или йонни връзки и е неспецифично по отношение на състава или последователността на нуклеотидите в молекулата на ДНК. Въпреки преобладаването им в общото количество, хистоните са представени от малко разнообразие от протеини: еукариотните клетки съдържат само 5-7 вида хистонови молекули. За разлика от хистоните, т.нар. нехистоновите протеини, в по-голямата си част, специфично взаимодействат с определени последователности от ДНК молекули; има много голямо разнообразие от видове протеини, включени в тази група (няколкостотин), и голямо разнообразие от функции, които изпълняват.
Хистоните са свързани с ДНК като молекулен комплекс, под формата на субединици или нуклеозоми. Преди това се смяташе, че ДНК е равномерно покрита с тези протеини, чиято връзка с ДНК се определя от свойствата на хистоните.
Хистоните са протеини, характерни само за хроматина и имат редица специални свойства. Това са основни или алкални протеини, чиито свойства се определят от относително високото съдържание на основни аминокиселини като лизин и аргинин. Това са положителните заряди на аминогрупите на лизин и аргинин, които определят солта или електростатичната връзка на тези протеини с отрицателните заряди на фосфатните групи на ДНК. Тази връзка е доста лабилна и лесно се прекъсва; в този случай може да настъпи дисоциация на DNP в ДНК и хистони. Поради тази причина хроматинът, дезоксирибонуклеопротеинът или както преди се е наричал нуклеохистон, е сложен нуклеиново-протеинов комплекс, който включва линейни високополимерни ДНК молекули и огромно разнообразие от хистонови молекули (до 60 милиона копия от всеки тип хистон на ядро).
Хистоните са биохимично най-изследваните протеини (виж Таблица 5).
Таблица 5. Общи свойства на хистоните на бозайниците
Хистоните са сравнително малки протеини в молекулно тегло. Тези протеини имат подобни свойства в почти всички еукариоти; Класовете хистони се различават един от друг по съдържанието на различни основни аминокиселини. Така хистоните H3 и H4 се класифицират като богати на аргинин, поради относително високото съдържание на тази аминокиселина в тях. Тези хистони са най-запазените от всички изследвани протеини: техните аминокиселинни последователности са почти еднакви дори при такива далечни видове като крава и грах (само две аминокиселинни замествания).
Другите два хистона, H2A и H2B, са умерено обогатени с лизин протеини. Различни обекти в тези хистонови групи показват междувидови вариации в тяхната първична структура и аминокиселинна последователност.
Хистон H1 не е уникална молекула, а клас протеини, състоящ се от няколко доста тясно свързани протеини с припокриващи се аминокиселинни последователности. Тези хистони показват значителни междувидови и междутъканни вариации. В същото време техните обща собственосте обогатен на лизин, което ги прави най-основните протеини, които лесно се отделят от хроматина във физиологични (0,5 М) разтвори. В разтвори с висока йонна сила (1-2 M NaCl) всички хистони са напълно отделени от ДНК и преминават в разтвор.
Хистоните от всички класове (особено Н1) се характеризират с клъстерно разпределение на основни аминокиселини, лизин и аргинин, в N- и С-краищата на молекулите. Средните участъци на хистоновите молекули образуват няколко (3-4) а-спирални участъка, които се уплътняват в глобуларна структура при изотонични условия (фиг. 56). Очевидно неспирализираните краища на хистоновите протеинови молекули, богати на положителни заряди, са отговорни за връзката им помежду си и с ДНК.
В хистона H1 най-променливият е N-краят, който комуникира с други хистони, а С-краят, богат на лизин, взаимодейства с ДНК.
По време на клетъчния живот могат да настъпят посттранслационни промени (модификации) на хистоните: ацетилиране и метилиране на някои лизинови остатъци, което води до загуба на броя на положителните заряди, и фосфорилиране на серинови остатъци, което води до появата на отрицателен заряд . Ацетилирането и фосфорилирането на хистоните трябва да са обратими. Тези модификации значително променят свойствата на хистоните и способността им да свързват ДНК. По този начин повишеното ацетилиране на хистони предхожда генното активиране, а фосфорилирането и дефосфорилирането са свързани съответно с кондензация и декондензация на хроматин.
Хистоните се синтезират в цитоплазмата, транспортират се до ядрото и се свързват с ДНК по време на нейната репликация в S периода, ᴛ.ᴇ. Синтезата на хистони и ДНК е синхронизирана. Когато една клетка спре синтеза на ДНК, хистоновите информационни РНК се разпадат в рамките на няколко минути и синтезът на хизон спира. Хистоните, включени в хроматина, са много стабилни и имат ниска степен на заместване.
Разделянето на хистоните на пет групи и тяхното достатъчно сходство във всяка група е общо взето характерно за еукариотите. При което цяла линияразлики в състава на хистоните се наблюдават както при висшите, така и при нисшите еукариотни организми. Така при нисшите гръбначни животни, вместо H1, който е характерен за всички тъкани на тези организми, в еритроцитите се намира хистон H5, който съдържа повече аргинин и серин. От друга страна, при редица еукариоти има липса на определени групи хистони, а в редица случаи и пълна замяна на тези протеини с други.
Хистоноподобни протеини са открити във вируси, бактерии и митохондрии. Така например в Е. coli протеините (HU и H-NS) се намират в големи количества в клетката, напомнящи хистони в аминокиселинен състав.
Функционални свойствахистони.Широкото разпространение на хистоните, тяхното сходство дори при много отдалечени видове, задължителното им включване в хромозомите, всичко това показва тяхната изключително важна роля в живота на клетките. Още преди откриването на нуклеозомите имаше две допълващи се групи хипотези за функционалната роля на хистоните, тяхната регулаторна и структурна роля.
Открито е, че изолираният хроматин, когато към него се добави РНК полимераза, трябва да бъде шаблон за транскрипция, но неговата активност е само около 10% от активността, съответстваща на активността на изолираната чиста ДНК. Тази активност нараства прогресивно с премахването на хистоновите групи и може да достигне 100% с пълно премахванехистони. От това може да се заключи, че общото съдържание на хистони може да регулира нивото на транскрипция. Това наблюдение е в съответствие с факта, че тъй като хистоните, особено H1, се отстраняват, настъпва прогресивна декондензация и разгъване на DNP фибрили, което вероятно улеснява взаимодействието на РНК полимераза с матрична ДНК. Установено е също, че модификацията на хистони води до повишена транскрипция и едновременно разграждане на хроматина. Следователно заключението предполага, че количественото и качественото състояние на хистоните влияе върху степента на компактност и активност на хроматина. В същото време остава отворен въпросът за спецификата на регулаторните свойства на хистоните: каква е ролята на хистоните в синтеза на специфични иРНК в различно диференцирани клетки. Този проблем все още не е решен, въпреки че могат да се направят някои обобщения: онези групи хистони, които са най-малко запазени, като H 1 или H 2 A и H 2 B, които могат да бъдат значително модифицирани и по този начин да променят свойствата си в определени региони на генома.
Структурната, уплътняваща роля на хистоните в организацията на хроматина също беше очевидна. По този начин постепенното добавяне на хистонова фракция към разтвори на чиста ДНК води до утаяване на DNP комплекса и обратно, частичното отстраняване на хистони от хроматиновите препарати води до преминаването му в разтворимо състояние. От друга страна, в цитоплазмени екстракти от ооцити на земноводни или яйца на морски таралежи, съдържащи свободни хистони, добавянето на каквато и да е ДНК (включително фаг) води до образуването на хроматинови фибрили (CFP), чиято дължина е няколко пъти по-къса от първоначалната ДНК. Тези данни показват структурна, уплътняваща роля на хистоните. За да могат огромни сантиметър дълги ДНК молекули да бъдат подредени по дължината на хромозома, която е с размери само няколко микрометра, ДНК молекулата трябва да бъде усукана по някакъв начин, уплътнена с плътност на опаковане 1: 10 000. Оказа се, че в процеса на уплътняване на ДНК има няколко нива на опаковане, първите от които се определят директно от взаимодействието на хистоните с ДНК.
Първото ниво на уплътняване на ДНК.Ранни биохимични и електронни микроскопски изследвания показват, че препаратите на DNP съдържат нишковидни структури с диаметър от 5 до 50 nm. Постепенно стана ясно, че диаметърът на хроматиновите фибрили зависи от метода на изолиране на лекарството.
Ултратънки участъци от интерфазни ядра и митотични хромозоми след фиксиране с глутаралдехид разкриват хроматизирани фибрили с дебелина 30 nm. Хроматиновите фибрили имат същите размери по време на физическото фиксиране на ядрата - с бързо замразяване на ядрата, отрязване на обекта и получаване на реплики от такива препарати. В последния случай ефектът от променливи химични условия върху хроматина беше изключен. Но всички тези
Строеж и химия на хроматина - понятие и видове. Класификация и особености на категория "Структура и химия на хроматина" 2017, 2018.
Хроматинът, основният компонент на клетъчното ядро, се получава доста лесно от изолирани интерфазни ядра и от изолирани митотични хромозоми. За да направят това, те използват способността му да преминава в разтворено състояние по време на екстракция с водни разтвори с ниска йонна сила или просто дейонизирана вода. В този случай участъци от хроматин набъбват и се превръщат в гел. За да се превърнат такива лекарства в истински разтвори, са необходими силни механични въздействия: разклащане, разбъркване, допълнителна хомогенизация. Това, разбира се, води до частично разрушаване на оригиналната структура на хроматина, раздробяването му на малки фрагменти, но практически не променя химичния му състав.
Хроматиновите фракции, получени от различни обекти, имат доста еднакъв набор от компоненти. Установено е, че общият химичен състав на хроматина от интерфазните ядра и митотичните хромозоми се различава малко един от друг. Основните компоненти на хроматина са ДНК и протеини, по-голямата част от които са хистони и нехистонови протеини (вижте таблица 3).
Таблица 3.Химичен състав на хроматина. Съдържанието на протеин и РНК е дадено спрямо ДНК
Средно около 40% от хроматина е ДНК и около 60% са протеини, включително специфични ядрени протеини - хистони, съставляват от 40 до 80% от всички протеини, които изграждат изолирания хроматин. Освен това хроматиновата фракция включва мембранни компоненти, РНК, въглехидрати, липиди и гликопротеини. Въпросът доколко тези второстепенни компоненти са включени в структурата на хроматина все още не е разрешен. Така, например, РНК може да бъде транскрибирана РНК, която все още не е загубила връзката си с ДНК шаблона. Други второстепенни компоненти могат да представляват вещества от коутаени фрагменти от ядрената мембрана.
Структурно, хроматинът е нишковиден комплекс от дезоксирибонуклеопротеинови (DNP) молекули, които се състоят от ДНК, свързана с хистони (виж Фиг. 57). Следователно друго име за хроматин се е вкоренило - нуклеохистон. Благодарение на асоциирането на хистоните с ДНК се образуват много лабилни, вариабилни комплекси нуклеинова киселина-хистон, където съотношението ДНК:хистон е приблизително едно, т.е. те присъстват в равни тегловни количества. Тези нишковидни DNP фибрили са елементарни хромозомни или хроматинови нишки, чиято дебелина, в зависимост от степента на пакетиране на ДНК, може да варира от 10 до 30 nm. Тези DNP фибрили могат от своя страна да бъдат допълнително уплътнени, за да образуват по-високи нива на DNP структуриране, до митотичната хромозома. Ролята на някои нехистонови протеини е именно в образуването на високи нива на уплътняване на хроматина.
ДНК хроматин
В хроматиновия препарат ДНК обикновено представлява 30-40%. Тази ДНК е двуверижна спирална молекула, подобна на чистата изолирана ДНК във водни разтвори. Това се доказва от много експериментални данни. По този начин, когато разтворите на хроматин се нагряват, се наблюдава повишаване на оптичната плътност на разтвора, така нареченият хиперхромен ефект, свързан с разкъсването на междунуклеотидните водородни връзки между ДНК веригите, подобно на това, което се случва, когато чистата ДНК се нагрява (стопи) .
Въпросът за размера и дължината на ДНК молекулите в хроматина е важен за разбирането на структурата на хромозомата като цяло. Използвайки стандартни методи за изолиране на ДНК, хроматинът има молекулно тегло 7-9 x 10 6, което е значително по-малко от молекулното тегло на ДНК от Escherichia coli (2,8 x 10 9). Такова относително ниско молекулно тегло на ДНК от хроматинови препарати може да се обясни с механично увреждане на ДНК по време на процеса на изолиране на хроматин. Ако ДНК се изолира при условия, които изключват разклащане, хомогенизиране и други влияния, е възможно да се получат много дълги ДНК молекули от клетките. Дължината на ДНК молекулите от ядрата и хромозомите на еукариотните клетки може да бъде изследвана с помощта на метода на светлинно-оптична авторадиография, точно както е изследвана върху прокариотни клетки.
Установено е, че в рамките на хромозомите дължината на отделните линейни (за разлика от прокариотните хромозоми) ДНК молекули може да достигне стотици микрометри и дори няколко сантиметра. По този начин, ДНК молекули с размери от 0,5 mm до 2 cm са получени от различни обекти. Тези резултати показват, че има тясно съответствие между изчислената дължина на ДНК на хромозома и авторадиографското наблюдение.
След лек лизис на еукариотни клетки, молекулните тегла на ДНК могат да бъдат директно определени чрез физикохимични методи. Доказано е, че максималното молекулно тегло на ДНК молекула на Drosophila е 41 x 10 9, което съответства на дължина от около 2 cm. При някои дрожди има ДНК молекула на хромозома с молекулно тегло 1 x 10 8. -10 9, което е с размери около 0,5 mm.
Такава дълга ДНК е една единствена молекула, а не няколко по-къси, зашити заедно в един файл с помощта на протеинови връзки, както смятат някои изследователи. До този извод се стигна, след като се оказа, че дължината на ДНК молекулите не се променя след третиране на лекарства с протеолитични ензими.
Общото количество ДНК, включено в ядрените структури на клетките, в генома на организмите, варира от вид на вид, въпреки че при микроорганизмите количеството ДНК на клетка е значително по-ниско, отколкото при безгръбначните, висшите растения и животните. Така една мишка има почти 600 пъти повече ДНК на ядро от Е. coli. Когато се сравнява количеството ДНК на клетка в еукариотните организми, е трудно да се установи някаква връзка между степента на сложност на организма и количеството ДНК на ядро. Такива различни организми като лен, морски таралеж, костур (1,4-1,9 pg) или овъглен и бик (6,4 и 7 pg) имат приблизително еднакво количество ДНК.
Има значителни колебания в количеството на ДНК в големи таксономични групи. Сред висшите растения количеството на ДНК в различните видове може да се различава стотици пъти, точно както сред рибите количеството на ДНК в земноводните се различава десетки пъти.
Някои земноводни имат 10-30 пъти повече ДНК в ядрата си, отколкото в човешките ядра, въпреки че генетичната конституция на хората е несравнимо по-сложна от тази на жабите. Следователно може да се предположи, че „излишното“ количество ДНК в по-ниско организираните организми или не е свързано с изпълнението на генетична роля, или броят на гените се повтаря един или друг брой пъти.
Таблица 4. Съдържание на ДНК в клетките на някои обекти (pg, 10 -12 g)
Оказа се, че е възможно да се решат тези проблеми чрез изучаване на кинетиката на реакцията на ренатурация или ДНК хибридизация. Ако фрагментираните ДНК молекули в разтвори се подложат на термична денатурация и след това се инкубират при температура, малко по-ниска от тази, при която се извършва денатурацията, тогава първоначалната двойноверижна структура на ДНК фрагментите се възстановява поради повторното обединяване на комплементарни вериги - ренатурация. За ДНК вируси и прокариотни клетки беше показано, че скоростта на такава ренатурация директно зависи от размера на генома; колкото по-голям е геномът, толкова по-голямо е количеството ДНК на частица или клетка, толкова повече време е необходимо за случайния подход на комплементарни вериги и специфичното повторно свързване на по-голям брой ДНК фрагменти, различни по нуклеотидна последователност (фиг. 53). Характерът на кривата на реасоцииране на ДНК на прокариотните клетки показва липсата на повтарящи се базови последователности в прокариотния геном; всички участъци от тяхната ДНК носят уникални последователности, чийто брой и разнообразие отразяват степента на сложност на генетичния състав на обектите и, следователно, тяхната обща биологична организация.
Напълно различна картина на реасоциацията на ДНК се наблюдава при еукариотните организми. Оказа се, че тяхната ДНК съдържа фракции, които се ренатурират с много по-висока скорост, отколкото би се очаквало въз основа на размера на техния геном, както и фракция от ДНК, която се ренатурира бавно, като уникалните ДНК последователности на прокариотите. Еукариотите обаче изискват значително повече време, за да ренатурират тази фракция, което е свързано с общия голям размер на техния геном и големия брой различни уникални гени.
В тази част от еукариотната ДНК, която се характеризира с висока степен на ренатурация, се разграничават две подфракции: 1) фракция с много или често повтарящи се последователности, където подобни ДНК участъци могат да се повторят 10 6 пъти; 2) фракция от умерено повтарящи се последователности, които се срещат 10 2 -10 3 пъти в генома. Така при мишки фракцията на ДНК с често повтарящи се последователности включва 10% от общото количество ДНК на геном и 15% се отчитат от фракцията с умерено повтарящи се последователности. Останалите 75% от цялата миша ДНК е представена от уникални региони, съответстващи на голям брой различни неповтарящи се гени.
Фракции с много повтарящи се последователности могат да имат различна плаваща плътност от по-голямата част от ДНК и следователно могат да бъдат изолирани в чиста форма като така наречените фракции сателитна ДНК. При мишката тази фракция е с плътност 1,691 g/ml, а основната част от ДНК е 1,700 g/ml. Тези разлики в плътността се определят от разликите в нуклеотидния състав. Например, в една мишка има 35% G и C двойки в тази фракция и 42% в основния пик на ДНК.
Както се оказа, сателитната ДНК или фракцията на ДНК с често повтарящи се последователности не участва в синтеза на основните видове РНК в клетката и не е свързана с процеса на синтез на протеини. Това заключение е направено въз основа на факта, че нито един от видовете клетъчна РНК (tRNA, mRNA, rRNA) не хибридизира със сателитна ДНК. Следователно, тези ДНК не съдържат последователности, отговорни за синтеза на клетъчна РНК, т.е. сателитните ДНК не са матрици за синтеза на РНК и не участват в транскрипцията.
Има хипотеза, че много повтарящи се последователности, които не са пряко включени в протеиновия синтез, могат да носят информация, която играе важна структурна роля в поддържането и функционирането на хромозомите. Те могат да включват множество участъци от ДНК, свързани с основните протеини на интерфазното ядро (виж по-долу), места в началото на репликация или транскрипция, както и участъци от ДНК, които регулират тези процеси.
Използване на метода на хибридизация на нуклеинови киселини директно върху хромозоми ( на място) е изследвана локализацията на тази фракция. За да се направи това, РНК, белязана с 3Н-уридин, се синтезира върху изолирана сателитна ДНК с помощта на бактериални ензими. След това цитологичният препарат с хромозоми се подлага на такава обработка, че настъпва денатурация на ДНК (повишена температура, алкална среда и др.). След това върху препарата се поставя 3H-маркирана РНК и се постига хибридизация между ДНК и РНК. Авторадиографията показва, че по-голямата част от етикета е локализирана в зоната на първичните стеснения на хромозомите, в зоната на техните центромерни области. Белегът се открива и в други региони на хромозомите, но много слабо (фиг. 54).
През последните 10 години бяха направени големи крачки в обучението центромерна ДНК, особено в клетките на дрождите. Така и направете S. cerevisiaeЦентромерната ДНК се състои от повтарящи се области от 110 bp. Състои се от две запазени области (I и III) и централен елемент (II), обогатен с AT базови двойки. Хромозомите на Drosophila имат подобна центромерна ДНК структура. Човешка центромерна ДНК (алфоидна сателитна ДНК) се състои от тандем от 170 bp мономери, организирани в групи от димери или пентамери, които на свой ред образуват големи последователности от 1-6 x 103 bp. Тази най-голяма единица се повтаря 100-1000 пъти. Специални центромерни протеини са в комплекс с тази специфична центромерна ДНК и участват в образуването кинетохор, структура, която осигурява връзката на хромозомите с вретеновидни микротубули и при движението на хромозомите в анафаза (виж по-долу).
ДНК със силно повтарящи се последователности също е открита в теломерни областихромозоми на много еукариотни организми (от дрожди до хора). Тук най-често се срещат повторения, които включват 3-4 гуанинови нуклеотида. При хората теломерите съдържат 500-3000 TTAGGG повторения. Тези участъци от ДНК изпълняват специална роля - да ограничат краищата на хромозомата и да предотвратят нейното скъсяване по време на процеса на повторна репликация.
Наскоро беше установено, че силно повтарящи се ДНК последователности на интерфазни хромозоми се свързват специфично с ламинови протеини, лежащи в основата на ядрената обвивка и участват в закрепването на разширени декондензирани интерфазни хромозоми, като по този начин определят реда в локализацията на хромозомите в обема на интерфазното ядро.
Предполага се, че сателитната ДНК може да участва в разпознаването на хомоложните области на хромозомите по време на мейозата. Според други предположения регионите с често повтарящи се последователности играят ролята на разделители (спейсъри) между различни функционални единици на хромозомна ДНК, например между репликони (виж по-долу).
Както се оказа, частта от умерено повтарящи се (от 10 2 до 10 5 пъти) последователности принадлежи към разнообразен клас от ДНК региони, които играят важна роля в процесите на създаване на апарата за синтез на протеини. Тази фракция включва рибозомни ДНК гени, които могат да се повторят 100 до 1000 пъти в различни видове. Тази фракция включва многократно повтарящи се региони за синтеза на всички тРНК. Освен това някои структурни гени, отговорни за синтеза на определени протеини, също могат да се повтарят много пъти, представени от много копия. Това са гените за хроматиновите протеини - хистони, повтарящи се до 400 пъти.
В допълнение, тази фракция включва ДНК участъци с различни последователности (100-400 нуклеотидни двойки всяка), също многократно повтарящи се, но разпръснати из целия геном. Тяхната роля все още не е напълно ясна. Предполага се, че такива ДНК участъци могат да представляват акцепторни или регулаторни области на различни гени.
И така, ДНК на еукариотните клетки е хетерогенна по състав, съдържаща няколко класа нуклеотидни последователности: често повтарящи се последователности (> 10 6 пъти), включени в сателитната ДНК фракция и нетранскрибирани; фракция от умерено повтарящи се последователности (10 2 -10 5), представляващи блокове от истински гени, както и къси последователности, разпръснати из целия геном; част от уникални последователности, които носят информация за повечето клетъчни протеини.
Въз основа на тези идеи разликите в количеството ДНК, които се наблюдават в различните организми, стават ясни: те могат да бъдат свързани с неравномерно съотношение на определени класове ДНК в генома на организмите. Така например в амфибия Амфиума(който има 20 пъти повече ДНК от човека) повтарящите се последователности съставляват до 80% от общата ДНК, в лука - до 70, в сьомгата - до 60% и т.н. Истинското богатство на генетична информация трябва да бъде отразено от частта от уникални последователности. Не трябва да забравяме, че в естествена, нефрагментирана ДНК молекула на хромозомата, всички региони, които включват уникални, умерено и често повтарящи се последователности, са свързани в една гигантска ковалентна ДНК верига.
ДНК молекулите са хетерогенни не само в области на различни нуклеотидни последователности, но също така се различават по своята синтетична активност.
Репликация на еукариотна ДНК
Бактериалната хромозома се репликира като една структурна единица, имаща една начална точка на репликация и една крайна точка. Така бактериалната кръгова ДНК е една репликон. От началната точка репликацията протича в две противоположни посоки, така че докато се синтезира ДНК, се образува така нареченото репликационно око, ограничено от двете страни с репликационни вилици, което се вижда ясно по време на електронно микроскопско изследване на вирусни и бактериални репликиращи се хромозоми .
В еукариотните клетки организацията на репликация е от различно естество - полирепликон Както вече беше споменато, с импулсното включване на 3 HT се появява множествен етикет в почти всички митотични хромозоми. Това означава, че едновременно има много места за репликация и много автономни източници на репликация в интерфазната хромозома. Това явление е изследвано по-подробно с помощта на авторадиография на белязани молекули, изолирани от ДНК (фиг. 55). Ако клетките са маркирани с 3 HT, тогава в светлинен микроскоп върху автографите на изолирана ДНК могат да се видят области с намалено сребро. под формата на пунктирани линии. Това са малки участъци от ДНК, които са успели да се репликират, а между тях има участъци от нерепликирана ДНК, която не е напуснала авторадиограф и следователно остава невидима. Тъй като времето за контакт на 3 NT с клетката се увеличава, размерът на тези сегменти се увеличава и разстоянието между тях намалява. От тези експерименти скоростта на репликация на ДНК в еукариотните организми може да бъде точно изчислена. Скоростта на движение на вилицата за репликация се оказа 1-3 kb. на минута при бозайници, около 1 kb. на минута в някои растения, което е много по-ниско от скоростта на репликация на ДНК в бактерии (50 kb на минута). В същите експерименти беше пряко доказана полирепликонната структура на ДНК на еукариотните хромозоми: по дължината на хромозомната ДНК, по протежение на нея, има много независими места за репликация - репликони. Според разстоянието между средните точки на съседни маркиращи репликони, т.е. Въз основа на разстоянието между две съседни начални точки на репликация може да се определи размерът на отделните репликони. Средно размерът на репликона на висшите животни е около 30 µm или 100 kbp. Следователно трябва да има 20 000-30 000 репликони в хаплоидния набор от бозайници. При нисшите еукариоти репликоните са по-малки, около 40 kb. Така при Drosophila има 3500 репликона на геном, а при дрождите – 400. Както беше споменато, синтезът на ДНК в репликона протича в две противоположни посоки. Това може лесно да се докаже чрез авторадиография: ако клетките, след импулсно маркиране, се оставят да продължат да синтезират ДНК за известно време в среда без 3 HT, тогава включването му в ДНК ще намалее, ще настъпи разреждане на етикета и на на авторадиографа ще бъде възможно да се види симетричен модел от двете страни на репликирания регион, намалявайки броя на зърната редуцирано сребро.
Репликиращите се краища или разклонения в репликон спират да се движат, когато срещнат разклоненията на съседни репликони (в крайна точка, обща за съседните репликони). В този момент репликираните участъци от съседни репликони се комбинират в единични ковалентни вериги от две новосинтезирани ДНК молекули. Функционалното разделяне на хромозомната ДНК на репликони съвпада със структурното разделяне на ДНК на домени или бримки, чиито основи, както вече беше споменато, се държат заедно чрез протеинови връзки.
По този начин целият ДНК синтез на една хромозома се осъществява чрез независим синтез на много отделни репликони, последван от свързване на краищата на съседни ДНК сегменти. Биологичният смисъл на това свойство става ясен при сравняване на синтеза на ДНК при бактерии и еукариоти. Така се синтезира бактериална монорепликонна хромозома с дължина 1600 микрона със скорост около половин час. Ако една сантиметър дълга ДНК молекула на хромозома на бозайник също се репликира като структура на монорепликон, това ще отнеме около седмица (6 дни). Но ако такава хромозома съдържа няколкостотин репликони, тогава пълната й репликация ще отнеме само около час. Всъщност времето за репликация на ДНК при бозайниците е 6-8 часа. Това се дължи на факта, че не всички репликони на отделна хромозома са включени по едно и също време.
В някои случаи се наблюдава едновременно включване на всички репликони или появата на допълнителни източници на репликация, което прави възможно завършването на синтеза на всички хромозоми за минимално кратко време. Това явление възниква в началото на ембриогенезата на някои животни. Известно е, че при смачкване на яйцата на ноктести жаби Ксенопус laevisСинтезът на ДНК отнема само 20 минути, докато в културата на соматичните клетки този процес продължава около един ден. Подобна картина се наблюдава при Drosophila: в ранните ембрионални стадии целият синтез на ДНК в ядрото отнема 3,5 минути, а в клетките на тъканната култура - 600 минути. В същото време размерът на репликоните в клетките на културата се оказа почти 5 пъти по-голям, отколкото в ембрионите.
Синтезът на ДНК протича неравномерно по дължината на отделната хромозома. Установено е, че в отделна хромозома активните репликони се събират в групи, репликативни единици, които включват 20-80 източника на репликация. Това следва от анализа на ДНК автографи, където се наблюдава точно такова блокиране на репликиращи се сегменти. Друга основа за идеята за съществуването на блокове или клъстери от репликони или репликационни единици са експерименти с включването на тимидинов аналог, 5'-бромодеоксиуридин (BrdU), в ДНК. Включването на BrdU в интерфазния хроматин води до факта, че по време на митоза областите с BrdU се кондензират в по-малка степен (недостатъчна кондензация) от тези области, където е включен тимидин. Следователно тези области на митотичните хромозоми, в които е включен BrdU, ще бъдат слабо оцветени по време на диференциалното оцветяване. Това прави възможно определянето на последователността на включване на BrdU с помощта на синхронизирани клетъчни култури, т.е. последователност на синтеза на ДНК по дължината на една хромозома. Оказа се, че включването на прекурсора в големи участъци от хромозомата се случва. Включването на различни секции става строго последователно през S-периода. Всяка хромозома се характеризира с висока стабилност на реда на репликация по дължината си и има свой собствен специфичен модел на репликация.
Клъстери от репликони, комбинирани в репликационни единици, са свързани с протеини на ядрената матрица (виж по-долу), които заедно с репликационните ензими образуват т.нар. клъстерозомите са зони в интерфазното ядро, в които се осъществява синтеза на ДНК.
Редът, в който се активират репликационните единици, вероятно може да се определи от структурата на хроматина в тези региони. Например, зоните на конститутивния хетерохроматин (близо до центромера) обикновено се репликират в края на S-периода, също така, в края на S-периода, част от факултативния хетерохроматин се удвоява (например, X хромозомата на женската); бозайници). Последователността на репликация на хромозомни участъци корелира особено ясно във времето с модела на диференциално оцветяване на хромозомите: R-сегментите принадлежат към сегментите с ранна репликация, G-сегментите съответстват на хромозомните участъци с късна репликация. С-сегментите (центромерите) са местата на последната репликация.
Тъй като в различните хромозоми размерът и броят на различните групи от различно оцветени сегменти са различни, това създава картина на асинхронното начало и край на репликацията на различните хромозоми като цяло. Във всеки случай последователността на началото и края на репликацията на отделните хромозоми в набора не е произволна. Съществува строга последователност на възпроизвеждане на хромозоми по отношение на другите хромозоми в набора.
Продължителността на процеса на репликация на отделните хромозоми не зависи пряко от техния размер. Така големите човешки хромозоми от група А (1-3) са белязани през целия S-период, както и по-късите хромозоми от група В (4-5).
По този начин синтезът на ДНК в еукариотния геном започва почти едновременно на всички хромозоми на ядрото в началото на S-периода. Но в същото време последователното и асинхронно включване на различни репликони се случва както в различни части на хромозомите, така и в различни хромозоми. Последователността на репликация на определен регион на генома е строго определена генетично. Това последно твърдение се доказва не само от модела на включване на етикета в различни сегменти на S-периода, но и от факта, че има строга последователност на поява на пикове в чувствителността на определени гени към мутагени по време на S -Период.
Ядрен хроматине комплекс от дезоксирибонуклеинови киселини с протеини, където ДНК е в различна степен на кондензация.
При светлинна микроскопия хроматинът изглежда като бучки с неправилна форма, които нямат ясни граници и се оцветяват с основни багрила. Слабо и силно кондензирани зони на хроматин плавно преминават една в друга. Въз основа на електронната и светлинната оптична плътност се разграничават електронно-плътен, ярко оцветен хетерохроматин и по-малко оцветен, по-малко електронно-плътен еухроматин.
Хетерохроматинът е зона от силно кондензирана ДНК, свързана с хистонови протеини. При електронна микроскопия се виждат тъмни бучки с неправилна форма.
Хетерохроматинът е гъсто опакована колекция от нуклеозоми. Хетерохроматинът, в зависимост от местоположението му, се разделя на париетален, матричен и перинуклеарен.
Париеталният хетерохроматин е в съседство с вътрешната повърхност на ядрената обвивка, матриксният хетерохроматин е разпределен в матрицата на кариоплазмата, а перинуклеарният хетерохроматин е в съседство с нуклеола.
Еухроматинът е област от слабо кондензирана ДНК. Еухроматинът съответства на участъци от хромозоми, които са станали дифузни, но няма ясна граница между кондензиран и декондензиран хроматин. Предимно нехистонови протеини са свързани с нуклеинови киселини в еухроматина, но има и хистони, които образуват нуклеозоми, които са свободно разпределени между участъци от некондензирана ДНК. Нехистоновите протеини показват по-слабо изразени основни свойства, по-разнообразни са по химичен състав и са много по-променливи в разделителната способност. Те участват в транскрипцията и регулират този процес. На нивото на трансмисионната електронна микроскопия еухроматинът е структура с ниска електронна плътност, състояща се от фини гранулирани и фини фибриларни структури.
Нуклеозомите са сложни дезоксирибонуклеопротеинови комплекси, съдържащи ДНК и протеини с диаметър около 10 nm. Нуклеозомите се състоят от 8 протеина - хистони H2a, H2b, H3 и H4, подредени в 2 реда.
Около протеиновия макромолекулен комплекс ДНК фрагментът образува 2,5 спирални навивки и обхваща 140 нуклеотидни двойки. Този участък от ДНК се нарича ядро и се обозначава като ядро на ДНК (nDNA). Областта на ДНК между нуклеозомите понякога се нарича линкер. Линкерните региони заемат около 60 базови двойки и са обозначени като iDNA.
Хистоните са нискомолекулни, еволюционно запазени протеини с различни основни свойства. Те контролират четенето на генетична информация. В областта на нуклеозомата процесът на транскрипция е блокиран, но ако е необходимо, спиралата на ДНК може да се „отвие“ и около нея се активира полимеризация на ядрена РНК. По този начин хистоните са важни като протеини, които контролират изпълнението на генетичната програма и специфичната функционална активност на клетката.
Както еухроматинът, така и хетерохроматинът имат нуклеозомно ниво на организация. Въпреки това, ако хистон H1 е прикрепен към линкерната област, тогава нуклеозомите се обединяват помежду си и настъпва по-нататъшна кондензация (уплътняване) на ДНК с образуването на груби конгломерати - хетерохроматин. В еухроматина не се наблюдава значителна кондензация на ДНК.
Кондензацията на ДНК може да възникне като суперзърна или соленоид. В този случай осем нуклеозоми са компактно съседни една на друга и образуват суперзърна. Както в соленоидния модел, така и в суперзърната, нуклеозомите най-вероятно лежат в спирала.
ДНК може да стане още по-компактна, образувайки хромомери. В хромомера дезоксирибонуклеопротеиновите фибрили се комбинират в бримки, държани заедно от нехистонови протеини. Хромомерите могат да бъдат разположени повече или по-малко компактно. Хромомерите стават още по-кондензирани по време на митозата, образувайки хромонема (нишковидна структура). Хромонемите се виждат под светлинен микроскоп, образуват се в профазата на митозата и участват в образуването на хромозоми, разположени спираловидно.
По-удобно е да се изследва морфологията на хромозомите, когато те са най-кондензирани в метафазата и в началото на анафазата. В това състояние хромозомите са оформени като пръчици с различна дължина, но с доста постоянна дебелина. В тях ясно се вижда първичната зона на стесняване, която разделя хромозомата на две рамена.
Някои хромозоми съдържат вторична констрикция. Вторичната констрикция е нуклеоларен организатор, тъй като по време на интерфазата в тези области се образуват нуклеоли.
Центромерите или кинетохорите са прикрепени към областта на първичното стесняване. Кинетохорът е дисковидна пластинка. Кинетохорите са свързани с микрорешетки, които са свързани с центриолите. Микротубулите „разкъсват“ хромозомите при митоза.
Хромозомите могат да варират значително по размер и съотношение на рамената. Ако раменете са равни или почти равни, тогава те са метацентрични. Ако едно от рамената е много късо (почти незабележимо), тогава такава хромозома е акроцентрична. Субметацентричната хромозома заема междинна позиция. Хромозомите с вторични стеснения понякога се наричат сателитни хромозоми.
Телцата на Бар (полов хроматин) са специални хроматинови структури, които се срещат по-често в клетките на жените. В невроните тези тела са разположени близо до ядрото. В епитела те лежат близо до стените и имат овална форма, в неутрофилите те изпъкват в цитоплазмата под формата на "барабан", а в невроните имат кръгла форма. Те се намират в 90% от женските и само 10% от мъжките клетки. Тялото на Бар съответства на една от X половите хромозоми, за която се смята, че е в кондензирано състояние. Идентифицирането на телата на Barr е важно за определяне на пола на животното.
Перихроматиновите и интерхроматиновите фибрили се намират в кариоплазмения матрикс и лежат или близо до хроматина (перихроматин), или разпръснати (интерхроматин). Предполага се, че тези фибрили са слабо кондензирани рибонуклеинови киселини, уловени в наклонен или надлъжен разрез.
Перихроматиновите гранули са частици с размер 30...50 nm, висока електронна плътност. Те лежат в периферията на хетерохроматина и съдържат ДНК и протеини; това е локален регион с плътно опаковани нуклеозоми.
Интерхроматиновите гранули имат висока електронна плътност, диаметър 20...25 nm и представляват сбор от рибонуклеинови киселини и ензими. Това може да са рибозомни субединици, транспортирани до ядрената обвивка.
Ако намерите грешка, моля, маркирайте част от текста и щракнете Ctrl+Enter.
Хроматинът е веществото на хромозомите - комплекс от ДНК, РНК и протеини. Хроматинът се намира в ядрото на еукариотните клетки и е част от нуклеоида в прокариотите. Именно в състава на хроматина се реализира генетичната информация, както и репликацията и възстановяването на ДНК.
При наблюдение на някои живи клетки, особено растителни клетки или клетки след фиксиране и оцветяване, вътре в ядрото се разкриват зони от плътна материя. Хроматинът се състои от ДНК в комплекс с протеин. В интерфазните клетки хроматинът може равномерно да запълни обема на ядрото или да бъде разположен в отделни бучки (хромоцентрове). Често той е особено ясно видим в периферията на ядрото (париетален, близо до мембраната хроматин) или образува преплитане на доста дебели (около 0,3 μm) и дълги нишки вътре в ядрото, образувайки подобие на вътрешноядрена верига.
Хроматинът на интерфазните ядра е тяло, носещо ДНК (хромозоми), което по това време губи своята компактна форма, разхлабва се и декондензира. Степента на такава хромозомна декондензация може да варира в ядрата на различните клетки. Когато една хромозома или част от нея е напълно декондензирана, тогава тези зони се наричат дифузен хроматин. Когато хромозомите са непълно разхлабени, в интерфазното ядро се виждат участъци от кондензиран хроматин (понякога наричан хетерохроматин). Доказано е, че степента на декондензация на хромозомния материал в интерфазата може да отразява функционалното натоварване на тази структура. Колкото по-дифузен е хроматинът на интерфазното ядро, толкова по-високи са синтетичните процеси в него. Намаляването на синтеза на РНК в клетките обикновено е придружено от увеличаване на зоните на кондензиран хроматин.
Хроматинът се кондензира максимално по време на митотичното клетъчно делене, когато се намира под формата на плътни тела - хромозоми. През този период хромозомите не носят никакви синтетични натоварвания; в тях не се включват прекурсори на ДНК и РНК.
В работно състояние, частично или напълно декондензирано, когато процесите на транскрипция и редупликация протичат с участието им в интерфазното ядро;
Неактивни - в състояние на метаболитен покой при максималната им кондензация, когато изпълняват функцията на разпределение и пренос на генетичен материал към дъщерните клетки.
Химически хроматиновите препарати са сложни комплекси от дезоксирибонуклеопротеини, които включват ДНК и специални хромозомни протеини - хистони. РНК е открита и в хроматина. В количествено отношение ДНК, протеин и РНК се намират като 1: 1, 3: 0, 2. Все още няма достатъчно недвусмислени данни за значението на РНК в състава на хроматина. Възможно е тази РНК да представлява свързана с лекарството функция на синтезираната РНК и следователно да е частично свързана с ДНК или да е специален тип РНК, характерен за структурата на хроматина.
Схема на кондензация на хроматин:
| Име на параметъра | Значение |
| Тема на статията: | Хроматин |
| Рубрика (тематична категория) | Биология |
Ядрен сок
Ядрена обвивка
Задача No1
Тема 5 Клетъчно ядро
1. Прочетете образователния материал по-долу.
2.Анализиране на таблици от приложението
3. Отговорете на въпроси за самоконтрол.
Основна структура
Ядрото е най-важният компонент на клетката.
Функции:
1.Съхраняване и възпроизвеждане на наследствена информация.
2. Регулиране на всички метаболитни процеси в клетката.
Ядрото на еукариотната клетка може да има различна форма: кръгла, елипсовидна, продълговата, зависи от вида на растението и животното, както и от вида, възрастта и функционалното състояние на клетката.
По правило една клетка има едно ядро. В същото време са известни многоядрени клетки; някои специализирани еукариотни клетки нямат ядро.
Ядрото на еукариотната клетка се състои от:
Ядрена обвивка
Ядрен сок
Хроматин
Отделя ядрото от цитоплазмата, осигурява нейната цялост и в същото време свързва ядрото с други части на клетката.
Ядрената обвивка се състои от две мембрани: външна и вътрешна. Външната мембрана образува издатини, чрез които се свързва с ER каналите. Рибозомите са прикрепени към него; вътрешната мембрана в контакт с кариоплазмата е лишена от тях. Ядрената обвивка съдържа много пори, през които се обменят молекули между ядрото и цитоплазмата. Областта между двете мембрани обикновено се нарича перинуклеарно пространство; тя свързва ядрото с ER. Поради наличието на пори, които осигуряват селективна представа, ядрената обвивка контролира обмена на вещества между ядрото и цитоплазмата
Полутечното вещество, което се намира под ядрената обвивка, представлява вътрешната среда на ядрото. Съдържа вода, протеини, вкл. повечето ядрени ензими, хроматинови протеини, аминокиселини, всички видове РНК. Кариоплазмата свързва всички ядрени структури
Набор от хромозоми. Това основен компонентядки.
Съставът на хроматина включва: ДНК, ПРОТЕИНИ, малко количество РНК, неорганични йони.
Функция – предаване на генетична информация.
На оцветените препарати клетките в покой представляват мрежа от тънки нишки, малки гранули или бучки. Основата на хроматина се състои от нуклеопротеини - дълги нишковидни ДНК молекули, свързани със специфични протеини. По време на процеса на ядрено делене нуклеопротеините спираловидно се скъсяват, уплътняват се в компакт хромозоми , които стават видими под светлинен микроскоп.
Хромозомата се състои от две вериги на ДНК - хроматид. Хромозомата е независима ядрена структура с рамена и първична стеснение центромер– зоната, към която са прикрепени нишките на вретеното по време на клетъчното делене. Центромерът разделя хроматида на две рамена. Хромозоми, които са идентични по форма и размер и носят едни и същи гени, се наричат хомоложни. Местоположението на центромера определя три основни типа хромозоми:
Равни рамене
Нередност
Пръчковидна
Хромозомни правила.
1. Във всички соматични клетки на тялото броят на хромозомите е еднакъв.
Половите клетки винаги съдържат наполовина по-малко хромозоми от соматичните клетки на даден тип организъм.
2. Всички организми, принадлежащи към един и същи вид, имат еднакъв брой хромозоми в клетките си.
Броят на хромозомите не зависи от нивото на организация и не винаги показва родство. Наборът от количествени и качествени характеристики на хромозомния набор се нарича кариотип.
Хромозомният набор от соматична клетка, в който всяка хромозома има двойка, се нарича диплоиден и се обозначава (2n). От всяка двойка хомоложни хромозоми само една попада в зародишните клетки и във връзка с това хромозомният набор от гамети се нарича хаплоиден и се обозначава (n).
Хроматин - понятие и видове. Класификация и характеристики на категория "Хроматин" 2017, 2018.
Половите хромозоми (гонозоми, хетерозоми) се различават както по структура (дължина, центромерна позиция, количество хетерохроматин), така и по генно съдържание. Хромозома X е субметацентрична хромозома със среден размер, част от група C). Има го в соматичните клетки... .
ЕУКАРИОТИ Хетерозис в растениевъдството Според степента на развитие на вегетативните органи, продуктивността, устойчивостта на болести, неприятели и неблагоприятни условия на околната среда. При растенията хетерозисът не се фиксира чрез размножаване със семена. Картофи, лук,...
Цитогенетичен анализ на кариотипа (въз основа на микроснимки на метафазни пластини). Таблица Извършване на анализ на пръстови отпечатъци За да направите свои собствени пръстови отпечатъци, имате нужда от следното оборудване:... .
Подгответе предметни стъкла и покривни стъкла: избършете ги с памучен тампон, напоен със спирт. Вземете шпатула и избършете единия край с алкохол. Прокарайте ръба на шпатулата по вътрешната повърхност на бузата, опитвайки се да отстраните епитела на лигавицата. Намажете остъргването на епитела върху...
Подобни статии
